Makaleye atıfta bulunmak için: London CA, Gardner HL, Mathie T, Stingle N, Portela R, Pennell ML, et al. (2015) Impact of Toceranib/Piroxicam/Cyclophosphamide Maintenance Therapy on Outcome of Dogs with Appendicular Osteosarcoma following Amputation and Carboplatin Chemotherapy: A Multi-Institutional Study. PLoS ONE 10(4): e0124889. doi:10.1371/journal.pone.0124889

Akademik Editor: Daniel Bouvard, Institut Albert Bonniot-INSERMU823, FRANSA
Sunum Tarihi: 6 Ekim 2014
Kabul Tarihi: 18 Mart 2015
Yayın Tarihi: 29 Nisan 2015

Telif Hakkı: © 2015 London et al. Bu makale, orijinal yazar ve kaynağa atıfta bulunulması koşuluyla, herhangi bir ortamda sınırsız kullanım, dağıtım ve çoğaltmaya izin veren Creative Commons Attribution License koşulları altında dağıtılan açık erişimli bir makaledir.

Veri Erişim Beyanı: İlgili tüm veriler makalede ve Ek Bilgi dosyasında yer almaktadır.

Finansman: Bu proje aşağıdaki fonlar ile desteklenmiştir: Translasyonel Bilimleri Geliştirme Ulusal Merkezi’nden UL1TR001070 ve Ulusal Kanser Enstitüsü’nden Ohio Eyalet Üniversitesi’ne P30CA016058. Bu klinik çalışma ve tedavi edilen köpekler için toceranib finansmanı Zoetis tarafından sağlanmıştır

☯ Söz konusu yazarlar bu çalışmaya eşit oranda katkıda bulunmuşlardır.

* london.20@osu.edu

Gerekli Bilgiler

Amputasyon ve karboplatin kemoterapisini takiben apendiküler osteosarkomlu (OSA) köpeklerde metronomik siklofosfamid/piroksikam tedavisine toceranib eklenmesinin hastalıksız  geçen süreyi (DFI) ve genel sağkalımı (OS) önemli ölçüde iyileştireceği varsayılmıştır. 

Metod ve Bulgular

Bu çalışma, ağır metastatik hastalığı olmayan OSA’lı köpeklerin (n = 126) amputasyonu takiben karboplatin kemoterapisi (4 doz) aldığı randomize, prospektif bir klinik çalışmadır. Çalışmaya girişte, köpekler kemoterapiyi tamamladıktan sonra toceranib ile birlikte veya toceranib olmadan piroksikam/siklofosfamid (n = her biri 63) almak üzere randomize edilmiştir. Hasta demografik özellikleri her iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermemiştir. Karboplatin kemoterapisi sırasında veya hemen sonrasında 32 köpekte (n = 13 toceranib; n = 19 kontrol) metastatik hastalık gelişmiş ve 13 köpek diğer tıbbi durumlar veya hasta sahibinin tercihi nedeniyle çalışmadan ayrılmıştır. Karboplatin kemoterapisinin ardından 81 köpek (n = 46 toceranib; n = 35 kontrol) metronomik tedavi almış; 35 köpekte (n = 20 toceranib; n = 15 kontrol) idame tedavisi sırasında metastatik hastalık gelişmiş ve 26 köpek diğer tıbbi durumlar veya hasta sahibinin tercihi nedeniyle çalışmadan ayrılmıştır. Dokuz toceranib ile tedavi edilen ve 11 kontrol köpeği amputasyondan 1 yıl sonra metastatik hastalık kanıtı olmadan çalışmayı tamamlamıştır. Toceranib ile tedavi edilen köpeklerde kontrol köpeklerine kıyasla daha fazla ishal, nötropeni ve kilo kaybı vakası görülmüştür, ancak bu toksisiteler düşük dereceli olup tipik olarak destekleyici bakım ile düzelmiştir. Kontrol köpeklerine (n = 1) kıyasla daha fazla toceranib ile tedavi edilen köpek (n = 8) tedaviyle ilişkili yan etkiler nedeniyle çalışmadan çıkarılmıştır. Kontrol grubu ve toceranib ile tedavi edilen köpekler için ortalama hastalıksız geçen süre (DFI) sırasıyla 215 ve 233 gün (p = 0,274); kontrol grubu ve toceranib ile tedavi edilen köpekler için ortalama genel sağkalım (OS) sırasıyla 242 ve 318 gün (p = 0,08) olmuştur. Kontrol grubu köpekler için bir yıllık sağkalım oranı %35 iken, toceranib alan köpekler için bu oran %38’dir. 

Sonuç

Amputasyon ve karboplatin kemoterapisini takiben metronomik piroksikam/siklofosfamid tedavisine toceranib eklenmesi, OSA’lı köpeklerde ortalama DFI, OS veya 1 yıllık sağkalım oranını iyileştirmemiştir.

Giriş

Osteosarkom (OSA) köpeklerde en sık görülen primer kemik tümörüdür ve rapor edilen tüm kemik neoplazilerinin %85’ini oluşturmaktadır [1]. Yalnızca amputasyon ile ortalama sağkalım süreleri 4-5 aya yaklaşırken, adjuvan kemoterapi ile ortalama sağkalım süreleri 8-12 aya çıkmaktadır [2]. Çeşitli kemoterapi protokollerinin ve yeni tedavi yaklaşımlarının kullanılmasına rağmen, sağkalımda klinik olarak anlamlı iyileşmeler sağlanamamıştır ve köpeklerin %90’ı tedaviden sonraki 2 yıl içinde metastatik hastalık nedeniyle ölmektedir [3-8].

OSA’lı köpeklerin çoğunun başlangıçta mikroskobik metastatik hastalığa sahip olduğu göz önüne alındığında, terapötik gelişimin bir diğer amacı da metastatik tümör hücrelerinin büyümesi için kritik olan tümör mikro-çevresindeki faktörleri etkilemek olmuştur. Özellikle, standart sitotoksik tedavi yaklaşımlarına alternatif olarak bağışıklık tepkilerinin modüle edilmesi ve tümörün kan kaynağı gibi kritik unsurlara erişiminin değiştirilmesi yönünde çabalar sarf edilmiştir.

Veteriner hekimlikte, metronomik kemoterapi tipik olarak piroksikam ve düşük doz siklofosfamidden oluşmaktadır ve çeşitli yayınlar bu yaklaşımla hem tümör mikroçevresinin hem de immün yanıtın modülasyonunu ortaya koymuştur [9-11]. Hem veteriner hekimliğinde hem de insan tıbbında, metronomik siklofosfamidin CD4+ Treg’leri aşağı regüle ettiği görülmüştür [11,12]. Yumuşak doku sarkomu olan köpeklerde 15 mg/m2/gün dozunda uygulanan metronomik siklofosfamid de tümör mikrodamar yoğunluğunda azalma ile ilişkilendirilmiştir [11]. Ayrıca, metronomik siklofosfamidin dolaşımdaki endotel öncüllerinin (CEP’ler) mobilizasyonunu ve canlılığını azalttığı görülmüştür [13,14].

NSAİİ’ler çoğu insan metronomik kemoterapi protokolünde yer almazken, piroksikam veteriner hekimlikte sıklıkla kullanılmaktadır, çünkü CEP’lerde COX- 2 ekspresyonunun hayatta kalmaları için önemli olduğu öne sürülmüştür. Bu nedenle COX-2 inhibisyonu, CEP’lerin tümör mikroçevresinde hayatta kalma ve çoğalma yeteneğini azaltabilir [15]. Köpek melanom kseno-greftleri olan farelerde metronomik siklofosfamid ile piroksikam kombinasyonu, tümör mikrodamar yoğunluğunda azalma, VEGF sekresyonunda azalma ve TSP-1 sekresyonunda artış ile sonuçlanmış ve metronomik kemoterapi ile NSAID’lerin eş zamanlı kullanılmasına yönelik görüşleri desteklemiştir [16].

Tümör anjiyogenezi ile ilgili olarak, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve reseptörünün (VEGFR) bu süreçte kritik rol oynadığı bilinmektedir. Endotel hücrelerinde VEGFR’nin aktivasyonu, endotel hücre sağkalımını, vasküler geçirgenliğin artmasını ve CEP’lerin mobilizasyonunu teşvik eden çoklu sinyal yollarını uyarır. Tümör hücreleri VEGF üretimi yoluyla VEGFR2 eksprese eden CEP’lerin kemik iliğinden tümör mikroçevresine göçünü sağlayabilir ve anti-VEGF/VEGFR tedavisinin sağkalım sinyalini ve CEP’lerin tümör büyüme bölgesine mobilizasyonunu azalttığı görülmüştür [17-20]. VEGF hem insan hem de köpek OSA’sında tespit edilebilir ve bu durum, malign potansiyelin artması ve kötü prognoz ile ilişkilendirilmiştir [21-25].

 İnsan kanser tedavisinde, küçük moleküller sunitinib, sorafenib ve pazopanib ve monoklonal antikor bevacizumab dahil olmak üzere VEGF/VEGFR sinyal ekseninin birkaç onaylı inhibitörü mevcuttur. Bu ilaçlar fare modellerinde kayda değer aktivite gösterirken, insanlarda anjiyogenez ve tümör progresyonu üzerindeki etkileri tartışmaya açıktır [26-29]. OSA ile ilgili olarak, birkaç çok hedefli VEGF inhibitörü OSA’nın murin ksenograft modellerinde değerlendirilmiş ve antitümör aktivite göstermiştir [30,31]. Ayrıca, gefitinib ile kombine edilen cediranib, OSA’lı bir hasta da dahil olmak üzere solid tümörlü hastalarda antitümör aktivite ve VEGF ve VEGFR2 seviyelerinde değişiklikler sergilemiştir [32]. Toceranib phosphate (toceranib; Palladia), VEGFR, PDGFR, KIT ve FLT-3 dahil olmak üzere çeşitli reseptör tirozin kinazların (RTK’lar) çok hedefli küçük moleküllü bir inhibitörüdür ve oral yoldan biyolojik olarak kullanılabilir bir anti-anjiyojenik ajan olarak geliştirilmiştir [33-35]. Tseranib, KIT inhibisyonu sayesinde köpek mast hücre tümörlerinin tedavisi için onaylanmış olsa da, muhtemelen toceranib tarafından inhibe edilen diğer RTK’ların düzensizliği nedeniyle köpeklerde de çeşitli tümörlere karşı aktivite görülmüştür [33,36]. Daha önce yayınlanan veriler, gün aşırı verilen 2,4-2,75 mg/kg toceranib dozlarının VEGFR2 inhibisyonunun taşıyıcı biyobelirteci olan plazma VEGF’de istatistiksel olarak anlamlı artışlar ile sonuçlandığını göstermektedir [37]. Bu nedenle, şu anda çeşitli tümörler için köpekleri tedavi etmek amacıyla kullanılan toceranib dozlarının da buna benzer bir etkiye sahip olması beklenmektedir.

Metastatik OSA ortamında, retrospektif bir çalışma, toceranib tedavisini takiben köpeklerin yaklaşık %48’inin klinik fayda (esas olarak stabil hastalıktan meydana gelen) gördüğünü göstermiştir [38]. Bu çalışmada, köpeklerin çoğu toceranib ile birlikte metronomik siklofosfamid ve/veya bir NSAID ile de tedavi edilmiştir. Daha yakın zamanda, toceranibin kanserli köpeklerde dolaşım halindeki düzenleyici T hücrelerinin seviyelerini düşürdüğü görülmüştür, bu da tümörler üzerindeki etkilerinin bir kısmının immünomodülasyon yoluyla ortaya çıkabileceğini düşündürmektedir [39].

 Metronomik kemoterapi ve VEGF/ VEGFR inhibitörlerinin potansiyel tamamlayıcı etkileri göz önüne alındığında, insan tıbbında farklı sonuçlarla kombine edilmişlerdir [26,40-42].

Bununla birlikte, ileri evre meme kanseri olan kadınlarda, kapesitabin veya metotreksat ile bevasizumb ve siklofosfamid kombinasyonları kullanılarak kayda değer sayıda hastada (%63,6-68) klinik fayda sağlandığı kanıtlanmıştır [26,42]. Bu veriler, anti-anjiyojenik hedefe yönelik tedavilerle birlikte sürekli düşük doz metronomik kemoterapi uygulanmasının mikroskobik metastatik hastalığı ele almak için geçerli bir strateji olabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, bu klinik çalışmanın amacı, amputasyon ve karboplatin kemoterapisini takiben apendiküler OSA’lı köpeklerde metronomik siklofosfamid ve piroksikam ile kombine edilen toceranib fosfatın hastalıksız aralık (DFI) ve genel sağkalım (OS) üzerindeki etkisini değerlendirmektir.

Materyal ve Metod

Uygunluk ve Etik Beyan

Ohio Eyalet Üniversitesi Veteriner Hekimliği Fakültesi Klinik Araştırma ve Danışma Komitesi ve Ohio Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) bu çalışmayı onaylamıştır. IACUC onayı ayrıca Wisconsin-Madison Üniversitesi, North Carolina Eyalet Üniversitesi, Texas A&M Üniversitesi, Minnesota Üniversitesi, Missouri Üniversitesi, Georgia Üniversitesi ve Colorado Eyalet Üniversitesi’nden de alınmıştır. Bu klinik araştırmaya katılan özel uzmanlık uygulamaları IACUC onayı gerektirmemektedir; klinik araştırmaya katılım, bu çalışma sahalarında baş araştırmacı olarak belirlenen Veteriner Tıbbi Onkoloğun takdirine bağlıydı (Hope Veteriner Uzmanları, Malvern, PA; Veteriner Kanser Topluluğu, Tustin, CA; New England Veteriner Onkoloji Topluluğu, Waltham, MA; Oradell Hayvan Hastanesi, Paramus, NJ; Güneydoğu Veteriner Onkoloji ve Tıp, Orange Park, FL; Sage Veteriner Uzmanlık ve Acil Bakım Merkezleri, Concord, CA; VCA Katonah Bedford Veteriner Merkezi, Bedford Hill, NY; Güneybatı Veteriner Onkoloji, Tuc- son, AZ; Carolinas Veteriner Uzmanlık Hastanesi, Cary, NC; Veteriner Uzmanlık Hastanesi, San Diego, CA; Veteriner Kanser Merkezi, Norwalk, CT). Çalışmaya katılmadan önce tüm hasta sahiplerinden bilgilendirilmiş onam alınmıştır.

Histolojik olarak doğrulanmış apendiküler osteosarkomu olan ve amputasyon geçirmiş gros metastatik hastalığı olmayan köpeklerin kayıtları kabul edilmiştir. Sadece uzun kemikleri içeren apendiküler bölgeler çalışmaya dahil edilmiştir. Kayıt öncesinde köpeklere torasik radyografiler, tam kan sayımı (CBC), serum biyokimya profili ve idrar tahlili gibi tanısal testler uygulanmıştır. Daha önce radyoterapi veya kemoterapi tedavisi görmüş veya karboplatin kemoterapisine başladıktan sonraki 72 saat içinde non-steroid anti-enflamatuar (NSAID) ilaçlar almış olan köpekler çalışmaya dahil edilmemiştir.

Çalışma Tasarımı

Amputasyon sonrası histolojik olarak doğrulanmış apendiküler osteosarkomu olan ve gross metastatik hastalık kanıtı bulunmayan toplam 126 köpek bu çalışmaya dahil edilmiştir. Çalışmaya başlamadan önce bilgisayar ortamında oluşturulmuş randomizasyon tablosu hazırlanmış ve hastalar kaydedildikçe çalışma grubu atamaları bu tabloya göre yapılmıştır. Kayıt sonrasında, köpekler karboplatin kemoterapisini tamamladıktan sonra toceranib (Zoetis, Florham Park, NJ tarafından sağlanmıştır) içeren veya içermeyen piroksikam/siklofosfamid almak üzere randomize edilmiştir. Tüm köpekler amputasyondan sonraki 14 gün içinde her üç haftada bir 4 kür tek ajan karboplatin (300 mg/m2 IV) ile tedaviye başlamıştır. Dördüncü karboplatin tedavisinden önce köpekler toraks radyografileri ile yeniden değerlendirilmiştir.

Pulmoner metastatik hastalık kanıtı olmayan köpekler 0,3 mg/kg PO EOD piroksikam ve 10 mg/m2 PO EOD siklofosfamid (toceranib ile dönüşümlü dozlama günü) ile birlikte veya toceranib olmadan 2,75 mg/kg PO gün aşırı (EOD) oral idame tedavisine başlamıştır; oral tedaviye dördüncü karboplatin tedavisinin tamamlanmasından 3 hafta sonra başlanmıştır. Oral idame tedavisinin başlangıcında tüm köpeklere her 12 saatte bir 0,5 mg/kg PO famotidin verilmiştir. Klorambusil, steril hemorajik sistit durumunda siklofosfamid yerine 5 mg/m2 PO EOD olarak uygulanmıştır. Köpekler oral idame tedavisine başladıktan 2 hafta sonra, sonraki 8 ay boyunca veya progresif hastalık kaydedilene kadar her 4 haftada bir değerlendirildi. CBC ve biyokimya profili her 4 haftada bir yapıldı; idrar tahlili oral idame tedavisine başladıktan sonra her 16 haftada bir alındı. Her 8 haftada bir toraks radyografileri ile yeniden görüntüleme yapıldı.

İlaç Çeşitleri ve Eşlik Eden İlaçlar

Siklofosfamid ve piroksikam, Apothecary Shoppe (şimdi Avella Specialty Pharmacy, Columbus, OH) tarafından birleştirilmiş ve doğrudan sahiplerine postalanmıştır. Apothecary Shoppe, Eczane Bileşim Akreditasyon Kurulu (PCAB) tarafından onaylanmıştır ve yanlış dozlama olasılığını azaltmak için kullanılmıştır. Klorambusil, Diamondback Drugs (Phoenix Arizona) tarafından siklofosfamid ile sistit/gastroenterit görülen 8 köpek için bileşik haline getirilmiştir. Toceranib, Pfizer Animal Heath (şimdi Zoetis) tarafından 10 mg, 15 mg ve 50 mg boyutlarında tabletler halinde sağlanmıştır.

Yan etkiler kaydedilmiş ve VCOG-CTCAE [43] kullanılarak derecelendirilmiştir. İlaca bağlı toksisiteleri önlemek ve/veya tedavi etmek için eşlik eden ilaçlar, ilgili klinisyenin takdirine bağlı olarak kullanıldı ve şunları içeriyordu: antibiyotikler (siprofloksasin, sefazolin, sefaleksin, amoksisilin klavulanik asit, trimetoprim-sülfametoksazol, enrofloksasin, marbofloksasin), anti-emetikler (ondansetron, maropitant, metoklopramid), gastrointestinal koruyucular (omeprazol, famotidin, sukralfat, pantoprazol, misoprostol, ranitidin), ishal önleyici (loperamid, metronidazol, Pepto-Bismol, probiyotikler) ve ağrı kesici (tramadol, gabapentin, buprenorfin, fentanil), proteinüri/hipertansiyon (benazepril, enalapril), karaciğer transaminazlarında artış meydana geldiğinde (Denamarin, SAMe).

İstatistiksel Analiz

Çalışmanın örneklem büyüklüğü hesaplamalarını yapmak için, amputasyon ve karboplatin kemoterapisi ile tedavi edilen osteosarkomlu 48 ve 155 köpekten oluşan iki önceki çalışmadan tarihsel kontrol grupları alınmıştır. Bu iki popülasyonda bildirilen 1 yıllık sağkalım oranı %35’tir [3,7]. 80 güç ve %95 güven varsayıldığında, tarihsel kontrol popülasyonunda bildirilen 1 yıllık sağkalım oranında %50 artış göstermek için her grupta 47 köpek gerekliydi. Yüksek yıpranma oranı nedeniyle, 32 ilave köpek (grup başına toplam 63 köpek) toplam 126 köpek olarak kaydedilmiştir. Hasta özellikleri tedavi grubuna göre özetlenmiştir (sürekli değişkenler için ortalama ± standart sapma (SD) ve kategorik değişkenler için frekans (%)). Amputasyon tarihi ile tespit edilebilir metastatik hastalık gelişimi arasındaki süre hastalıksız geçen süre (DFI) şeklinde tanımlanmıştır. Ölüm veya son takip sırasında belgelenmiş metastatik hastalığı olmayan köpekler DFI analizinden sansürlenmiştir. Nekropsi incelemesi gerekli değildi, ancak hastalığın ilerlediğine dair radyografik, sitolojik/histopatolojik kanıtları olan köpekler DFI analizine dahil edildi. Genel sağkalım (OS), amputasyondan ölüm veya ötenazi tarihine kadar geçen süre olarak tanımlanmıştır. Köpekler son takip tarihinde hayattaysa veya takibi kaybedilmişse sağkalım analizinden sansürlenmiştir. Kaplan-Meier eğrileri her grup için DFI ve OS’yi tanımlamak için kullanılmış ve Cox regresyonu, başlangıçta gruplara göre farklılık gösterdiği tespit edilen özelliklere göre ayarlanarak DFI veya OS’de herhangi bir fark olup olmadığını test etmek için kullanılmıştır. Hastalığa özgü ölümlerin eksik raporlanmasını önlemek için hastalığa özgü sağkalım yerine OS seçilmiştir. Cox regresyonunun orantılı tehlikeler (PH) varsayımının ihlal edilip edilmediğini belirlemek için Schoenfeld Artıklarının [44,45] grafikleri ve zamanla etkileşim testleri (log dönüştürülmüş) kullanılmıştır.

Sonuçlar

Hasta Demografik Özellikleri

Bu çalışma, Eylül 2010’dan Ağustos 2012’ye kadar toplam 126 köpeğin (63 toceranib ile tedavi edilen, 63 kontrol) kaydedildiği çok kurumlu bir çalışmadır. Kontrol grubundaki hastalar daha ağırdı ve erkek olma olasılıkları daha yüksekti (Tablo 1). Bu nedenle, Cox regresyon analizlerinde hasta ağırlığı ve cinsiyeti (kısırlaştırılmış erkek/kısırlaştırılmış dişi durumu göz ardı ederek erkek, dişi) için ayarlamalar yapılmıştır.

Dozaj ve İlaç Değişiklikleri

Tüm köpekler için başlangıç karboplatin dozu 300 mg/m2 idi. Çalışma sırasında uygulanan ortalama karboplatin dozu 300 mg/m2 idi.

On dokuz köpekte doz ayarlaması yapılmıştır (aralık: 250-290 mg/m2). Dört köpekte birden fazla doz ayarlaması yapılmıştır. Yan etkiler nedeniyle karboplatin dozunda 33 köpekte gecikme meydana gelmiştir. Uygulanan ortalama toceranib dozu 2,73 mg/kg EOD idi. Yirmi yedi köpekte toceranib doz azaltımı yapılmıştır. Ayrıca, 10 köpekte yan etkiler nedeniyle tedaviye yeniden başlanmadan önce geçici olarak toceranib kesilmiştir. İlaç kesintisi genellikle 1 hafta sürmüştür. Siklofosfamid kaynaklı sistit, 7 köpeğin siklofosfamidden 5 mg/m2 EOD’de klorambusile geçmesine neden olmuştur. Gastrointestinal yan etkiler nedeniyle 1 köpekte siklofosfamid yerine klorambusil kullanılmıştır.

Hastalara İlişkin Sonuçlar

Otuz iki köpekte (%25) 14. haftada oral tedaviye başlamadan önce ilerleyici hastalık gelişmiştir ve bunların 12’sinde pulmoner parankim dışında metastatik lezyonlar gelişmiştir. Bu durum, apendiküler OSA’lı köpeklerde karboplatin kemoterapisi ile ilgili önceki raporlarla tutarlılık göstermektedir. On üç köpek oral idame tedavisine başlamadan önce sahibinin tedaviye uyumsuzluğu veya diğer tedaviyle ilgisi olmayan tıbbi durumlar nedeniyle tedaviden çekilmiştir. Çalışmaya dahil edilen 126 köpekten 81’i (%64) metronomik tedavi almıştır. Toceranib ile oral tedavi alan 46 köpekten 9’u çalışma protokolünü tamamlamış, 20’si metastatik hastalık geliştiği için, 17’si ise sahibinin tedaviye uymaması veya diğer tedaviyle ilgisi olmayan tıbbi durumlar nedeniyle tedaviden çekilmiştir. Toceranib olmadan oral tedavi alan kontrol grubundaki 35 köpekten 11’i çalışma protokolünü tamamlamış, 15’i metastatik hastalık gelişimi nedeniyle geri çekilmiş ve 9’u da sahibinin uyumsuzluğu veya diğer ilgisiz tıbbi durumlar nedeniyle geri çekilmiştir.

Tedavi amaçlı analizde rapor edilen ortalama DFI, toceranib ile tedavi edilen köpekler için 233 gün ve kontrol köpekleri için 215 gündü (p = 0.274, Şekil 1A, Tablo 2 ve 3). Bağlılık analizinde bildirilen ortalama DFI, toceranib ile tedavi edilen köpekler için 223 gün ve kontrol köpekleri için 198 gündü (p = 0.3, Şekil 1B, Tablo 2 ve 3). Ortalama OS, toceranib ile tedavi edilen ve kontrol köpekleri için sırasıyla 318 gün ve 242 gündü (p = 0,08) (Şekil 2, Tablo 2 ve 3). DFI tedavi grupları arasında benzerdi, ancak kısa vadeli mortalite riskinde zamana bağlı bir fark vardı (Şekil 2 ve Tablo 3). Başlangıçta, mortalite tehlikesi kontrol hastaları arasında daha fazlaydı, ancak yaklaşık 400 günde riskler birbirine yaklaştı ve bir yıl (p = 0.961) ve iki yılda (p = 0.316) önemli bir fark göstermedi. Toceranib ile tedavi edilen grubun 1 ve 2 yıllık sağkalım oranları kontrol grubununkilerden belirgin şekilde farklı değildi (sırasıyla p = 0,963 ve 0,325) (Tablo 2). Kanseri proksimal humerus yerleşimli hastalarda ortalama DFI (182 gün, p = 0.281) ve OS (243 gün, p = 0.28) daha kısaydı, ancak bu fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (Tablo 4). Ayrıca, proksimal humerus yerleşimi tedavi grupları arasındaki farkları etkilememiştir (her bir sağkalım sonucu için p > 0.28).

Yan Etkiler

Yan etkiler daha önce karboplatin ve toceranib için rapor edilenlere benzerdi. Grade 1 (n = 77) ve 2 (n = 18) nötropeni ve grade 1 trombositopeni (n = 26) karboplatin kemoterapisi sırasında gözlenen en yaygın hematolojik yan etkilerdi. Grade 1 diyare (n = 31), letarji (n = 22) ve kusma (n = 18) da karboplatin uygulaması sırasında yaygın olarak bildirilmiştir. Oral tedavi sırasında gözlenen başlıca toksisiteler gastrointestinal ve hematolojiktir. S1 Tablosu Poisson regresyonu kullanılarak modellenebilecek kadar yaygın olan tüm olaylar için yan etki oranlarını göstermektedir. Toceranib’e randomize edilen hastalar, kontrole randomize edilen hastalara göre daha fazla diyare, nötropeni ve kilo kaybı atakları yaşamıştır, ancak bu toksisiteler düşük derecelidir ve tipik olarak destekleyici bakım ve doz modifikasyonları ile düzelmiştir. Yan etkiler nedeniyle ilacın geçici olarak kesilmesi genellikle 1 hafta sürmüştür. İlacın 2 haftadan daha uzun süre kesilmesini gerektiren köpekler çalışmadan çıkarılmıştır.

Gastrointestinal. On üç köpek toceranib kullanırken grade 1 kusma yaşamış, bunlardan ikisi birden fazla atak geçirmiştir. Toceranib ile tedavi edilen bir köpekte pankreatit ile birlikte grade 4 kusma ve ishal gelişmiştir. Kusma ve ishal destek tedavisiyle ve ilacın geçici olarak kesilmesiyle düzelmiştir. On kontrol köpeğinde grade 1 kusma görülmüş, 3 köpekte birden fazla atak yaşanmıştır. On yedi toceranib ile tedavi edilen köpekte grade 1 diyare gelişmiş ve 12 köpekte 1’den fazla atak görülmüştür. On altı köpekte toceranib kullanırken grade 2 diyare gelişmiştir ve 6 köpekte 1’den fazla atak görülmüştür.

Toceranib ile tedavi edilen iki köpekte grade 3 diyare gelişmiş, bir köpekte 3 diyare epizodu görülmüştür. Grade 3 diyaresi olan her iki köpek de gastrointestinal yan etkiler nedeniyle çalışmadan çıkarılmıştır.

Hematolojik. Grade 1 nötropeni, toceranib ile tedavi edilen köpeklerde en sık görülen hematolojik yan etkiydi ve 14 köpekte geçici nötropeni görüldü. Geçici düşük gradeli hematolojik toksisite nedeniyle doz ayarlaması veya ilacın geçici olarak kesilmesi gerekmemiştir. Toceranib alan altı köpekte ve 8 kontrol köpeğinde grade 1 trombositopeni görülmüştür. Bir köpekte yaygın metastatik hastalık ortamında meydana gelen grade 5 trombositopeni görülmüştür.

Nöromasküler. Toceranib ile tedavi edilen 4 köpekte ve 3 kontrol grubunda grade 1 ve 2 halsizlik görülmüştür. Toceranib alan iki köpekte grade 3 halsizlik gelişmiştir ve 1 köpekte üç ayrı atak meydana gelmiştir. Her iki köpekte de her bir epizod toceranibin geçici olarak kesilmesiyle düzelmiştir. Toceranib ile tedavi edilen 8 köpekte ve 5 kontrol köpeğinde ilerleyici hastalık olmaksızın düşük dereceli kas-iskelet ağrısı/zayıflığı kaydedilmiştir.

Diğer. Bu çalışmaya dahil edilen köpeklerde gözlenen diğer yan etkiler şunlardır: yüksek kreatinin kinaz; otitis media; ateş; idrar yolu enfeksiyonu; epistaksis; strangüri; hiperglisemi; hipoglisemi; indolent oküler ülser; nöbet; titreme/panting; deri eritemi; piyoderma; hiperkalemi; hipokalemi; hipoalbuminemi; hiperkalsemi; ataksi; motor nöropati; duyusal nöropati. Bu yan etkilerin toceranib/oral tedavi ile ilişkili olmadığı ve muhtemelen hastalığın ilerlemesini veya diğer komorbid durumları temsil ettiği düşünülmektedir.

Tartışma

OSA’lı köpekler için amputasyon ve adjuvan kemoterapinin faydaları veteriner hekimlikte kabul görmüştür, ancak çoğu köpek amputasyon ve adjuvan kemoterapiden sonraki 1 yıl içinde metastatik hastalığa yenik düşmektedir ve çoğu çalışmada 2 yıllık sağkalım oranları sadece %10-15 olarak bildirilmiştir [8,46]. Sonucu iyileştirmeye yönelik çok sayıda girişime rağmen, hasta köpekler için sağkalımı uzatma konusunda çok az ilerleme kaydedilmiştir. Bu klinik çalışmanın amacı, amputasyon ve karboplatin kemoterapisini takiben apendiküler OSA’lı köpeklerde piroksikam ve siklofosfamidin tek başına veya toceranib ile birlikte kullanıldığı metronomik kemoterapinin hem hastalıksız periodu hem de genel sağkalımı etkileyip etkilemeyeceğini belirlemektir. Bu çalışmanın sonuçları, toceranib ile piroksikam ve siklofosfamid metronomik tedavisinin, tek başına piroksikam ve siklofosfamide kıyasla apendiküler OSA’lı köpeklerde ortalama hastalıksız geçen süreyi, ortalama sağkalım süresini veya 1 yıllık sağkalım oranını iyileştirmediğini göstermiştir.

Bu çalışmada rapor edilen ortalama DFI ve sağkalım süreleri, amputasyondan sonra karboplatin kemoterapisi alan köpekler için rapor edilenlerle benzerlik göstermektedir [3,7]. Ayrıca, toceranib ile tedavi edilen köpekler ve kontrol grubu köpekler için sırasıyla %38,4 ve %34,9 olan 1 yıllık sağkalım oranları, tek başına karboplatin için bildirilen %35,4’lük 1 yıllık sağkalım oranıyla karşılaştırılabilir. Benzer sonuçlar tek başına veya karboplatin ile kombinasyon halinde doksorubisin, tek başına sisplatin ve gemsitabin ile eş zamanlı olarak verilen karboplatin ile de elde edilmiştir [5,8,47-49]. Yakın zamanda yapılan retrospektif bir çalışmada, amputasyon sonrası köpek apendiküler OSA için kullanılan çoklu kemoterapi protokolleri karşılaştırılmıştır. Doz yoğunluğu ve seçilen kemoterapi protokolündeki farklılıklar, sırasıyla 291 gün ve 284 gün olarak bildirilen ortalama DFI ve OS’yi önemli derecede etkilememiştir [8]. Bu veriler, mevcut sitotoksik kemoterapötikler kullanılarak mikroskobik metastatik hastalığı tedavi etmek için terapötik yaklaşımların değiştirilmesinin OSA’lı köpekler için kayda değer bir fayda sağlayamayacağı görüşünü desteklemektedir.

Bu çalışmada rapor edilen ortalama DFI ve sağkalım süreleri, amputasyondan sonra karboplatin kemoterapisi alan köpekler için rapor edilenlerle benzerlik göstermektedir [3,7]. Ayrıca, toceranib ile tedavi edilen köpekler ve kontrol grubu köpekler için sırasıyla %38,4 ve %34,9 olan 1 yıllık sağkalım oranları, tek başına karboplatin için bildirilen %35,4’lük 1 yıllık sağkalım oranıyla karşılaştırılabilir. Benzer sonuçlar tek başına veya karboplatin ile kombinasyon halinde doksorubisin, tek başına sisplatin ve gemsitabin ile eş zamanlı olarak verilen karboplatin ile de elde edilmiştir [5,8,47-49]. Yakın zamanda yapılan retrospektif bir çalışmada, amputasyon sonrası köpek apendiküler OSA için kullanılan çoklu kemoterapi protokolleri karşılaştırılmıştır. Doz yoğunluğu ve seçilen kemoterapi protokolündeki farklılıklar, sırasıyla 291 gün ve 284 gün olarak bildirilen ortalama DFI ve OS’yi istatistiksel olarak önemli ölçüde etkilememiştir [8]. Bu veriler, mevcut sitotoksik kemoterapötikler kullanılarak mikroskobik metastatik hastalığı tedavi etmek amacıyla terapötik yaklaşımların değiştirilmesinin OSA’lı köpekler için önemli bir fayda sağlamayacağı fikrini desteklemektedir.

Metronomik siklofosfamid kullanımının, siklofosfamid 15 mg/m2/gün uygulandığında tümör taşıyan köpeklerde dolaşımdaki düzenleyici T hücrelerinin (Treg) sayısını ve tümör mikrodamar yoğunluğunu azalttığı da görülmüştür [11]. Ne yazık ki, metronomik kemoterapi protokollerinde kullanılan dozlar ve rejimler büyük ölçüde anekdot niteliğindedir ve OSA’lı köpeklerde klinik faydayı öngören biyobelirteçler kapsamlı bir şekilde değerlendirilmemiştir. Bu çalışmada siklofosfamid ve piroksikam sırasıyla 10 mg/m2 ve 0,3 mg/kg EOD dozlarında uygulanmıştır. Bu tedavi rejimi, daha yüksek dozlarda siklofosfamidin immünomodülatör ve antianjiyojenik etkilerinin ortaya konmasından önce, çalışmanın başlangıcında mevcut literatüre dayanılarak oluşturulmuştur. Daha yüksek dozlarda kullanılan siklofosfamidin rapor edilen immünomodülatör ve anti-anjiyojenik etkileri göz önüne alındığında, bu çalışmada siklofosfamidin daha düşük dozda kullanılması ve EOD doz kullanımı, tümör mikroçevresini, devrede olan Treg sayısını veya her ikisini de önemli ölçüde etkilemede yetersiz kalmış olabilir.

Metastatik köpek apendiküler osteosarkomunda toceranibin biyolojik etkinliği rapor edilmiş olsa da [37], mevcut çalışmada DFI ve OS’de iyileşme olmaması, köpek OSA’sında hastalığın farklı aşamalarında farklı moleküler etkenler olabileceğini düşündürmektedir. Toceranib tedavisini takiben makroskopik metastatik pulmoner lezyonları olan köpeklerde tümör büyümesi üzerinde etkili olurken, mikroskopik lezyonların kısa bir süre içinde tedaviye dirençli hale gelmesi ve böylece herhangi bir potansiyel terapötik değeri ortadan kaldırması muhtemeldir. Çeşitli fare modellerinden elde edilen veriler, VEGF inhibitörlerinin tümör mikro ortamını metastatik tümör büyümesini gerçekten hızlandırabilecek şekilde modüle ettiğini göstermiştir [28,29,52].

Bu nedenle, VEGFR inhibitörlerinin mikroskobik hastalık ortamında kullanılmasının aslında daha agresif bir fenotipi teşvik edebileceği endişesi söz konusudur. Bu çalışmada, mikroskobik metastatik OSA’lı köpeklerde toceranib kullanımının, tedavi sonrasında daha agresif bir hastalık fenotipinin indüklendiğini gösterecek şekilde sağkalım sürelerinde kısalma veya anormal metastaz paternleri ile sonuçlanmadığı ortaya konmuştur.

Yakın zamanda, kanser taşıyan köpeklere 2,75 mg/kg EOD toceranib uygulanması, muhtemelen dolaylı immünomodülatör mekanizmalar yoluyla dolaşımdaki Treg’lerde önemli bir azalma ile ilişkilendirilmiştir [39]. Tescilli dozun altındaki toceranib dozları (2,4-2,9 mg/kg EOD arasında değişen) hala hedef inhibisyonu ile sonuçlanmakta ve bu çalışmada 2,75 mg/kg kullanımını desteklemektedir [37]. Bu nedenle, burada bildirilen DFI ve OS’deki iyileşme yetersizliği, mevcut etiket dozundan daha düşük toceranib dozunun kullanılmasına bağlı değildir. VEGFR inhibisyonu bu çalışmada spesifik olarak değerlendirilmemiş olsa da, toceranib tedavisini takiben plazma VEGF konsantrasyonlarının yükselmesi daha önce 2,4-2,9 mg/kg EOD alan köpeklerde etkili VEGFR2 inhibisyonu ile tutarlılık göstermiştir [37].

 Siklofosfamid yerine klorambusil uygulanmasını gerektiren yan etkiler 8 köpekte meydana gelmiş ve bunlardan biri hariç hepsi steril sistite bağlı görülmüştür. Siklofosfamid kaynaklı sistitin genel insidansı veteriner literatüründe düşüktür ve artan risk daha yüksek kümülatif siklofosfamid dozu ve daha yüksek doz yoğunluğu ile ilişkilendirilmiştir [53]. Her grupta sistit görülen çok az sayıda köpek olduğundan (n = 2 kontrol, n = 5 toceranib), toceranib ile tedavi edilen daha fazla sayıda köpekte sistit görülmesi muhtemelen tesadüftür. Metronomik klorambusil kullanımı, çeşitli spontan köpek tümörlerinde bazı antitümör aktivitelerle ilişkilendirilmiştir ve klorambusil alan köpeklerde dolaşımdaki Treg sayılarında başlangıca kıyasla azalmalar olduğu tespit edilmiştir [51]. Metronomik siklofosfamid ve klorambusilin immünomodülatör etkileri bildirilmiş olsa da, bu çalışmada klorambusil uygulamasının etkisi bilinmemektedir. Bununla birlikte, siklofosfamid yerine bu ilacı almaya devam eden az sayıda köpek olduğu göz önüne alındığında, her iki grupta da sonucu önemli ölçüde etkilemesi pek mümkün değildir.

Proksimal humerusta meydana gelen OSA’nın prognostik önemi hakkında çok sayıda araştırma rapor edilmiştir [3,7,54-57]. Mevcut çalışmada proksimal humerus yerleşimli tümörlü köpeklerde sağkalım sürelerinde azalma kaydedilirken, OS’deki fark diğer tümör yerleşimleriyle karşılaştırıldığında anlamlı değildi. Bu durum, çalışmaya proksimal humerus hastalığı ile katılım gösteren köpek sayısının az olmasından kaynaklanmış olabilir (n = 31). Alternatif olarak, metronomik tedavinin bu popülasyonda sağkalımı iyileştirmek için sonuç üzerinde etkili olması mümkündür. Bu hasta alt grubunda metronomik kemoterapinin faydalarını belirlemek için gelecekte kontrollü çalışmalar yapılması gerekmektedir.

Toceranib ile tedavi edilen köpekler, kontrol köpeklerine kıyasla daha yüksek yan etki profiline sahip olmakla birlikte, bildirilen yan etkiler daha önce yayınlanmış çalışmalara dayanarak beklenenlerle tutarlılık göstermekteydi. Mevcut çalışmada, toceranib kullanırken yan etki yaşayan köpeklerin ilaca ara verme, eşlik eden ilaçlar ve/veya doz azaltımı ile etkili bir şekilde tedavi edildiğini belirtmek önemlidir. Yan etkilerin sıklığı, 2,4-2,9 mg/kg dozlarında toceranib alan çeşitli solid tümörlü köpekler üzerinde yapılan yakın tarihli bir klinik çalışmada bildirilenden daha düşüktür [37]. Bu çalışmada, yan etki profili toceranibin tescilli dozuyla (3,25 mg/kg) ilişkili olandan çok daha yüksek olmuş, ancak hem yeterli ilaç maruziyeti hem de biyolojik aktivite korunmuştur [37]. Çeşitli çalışmalardan elde edilen bulguların karşılaştırılmasındaki doğal zorluklara rağmen, bu çalışmada kullanılan toceranib dozu (2.75 mg/kg) tescilli doza kıyasla daha iyi tolere edilmiş ve tedavi protokolüne daha iyi uyulmasını sağlamıştır [36,37].

Mevcut çalışmada nekropsi gerekmediği ve metastatik hastalığın tespiti büyük ölçüde klinik bulgulara ve toraks radyografilerine bağlı olduğu için, birçok köpekte diğer bölgelerdeki gros metastatik hastalığın gözden kaçmış olması olası değildi. Abdominal ultrason ile tespit edilebilen gross OSA metastazı insidansı daha önce rapor edilmiş olup, pulmoner metastatik hastalık kanıtı olmayan köpeklerin %0-1,7’sinde abdominal metastaz tespit edilmiştir [58,59]. Ayrıca, ilk muayene sırasında (amputasyondan önce) apendiküler OSA’lı köpeklerde nükleer sintigrafi ile şüphe uyandırmayan osseöz metastaz tespit etme oranı %7,8 olarak bildirilmiştir [60]. Bu nedenle, nekropsi yapılmaması gerçek metastaz insidansının eksik bildirilmesine katkıda bulunmuş olsa da, torasik radyografi, amputasyon ve kemoterapi sonrası çoğu köpekte metastatik hastalığı tespit etmek için güvenilir bir teşhis prosedürü olarak kabul edilir ve ekstratorasik metastazlar genellikle klinik belirtiler (örneğin, kemik metastazı için topallık) sayesinde tespit edilir.

Bileşik terapötiklerin kullanımının sonuçlarımızı etkilemiş olması mümkündür. The Apothecary Shoppe (şimdi Avella Specialty Pharmacy), Eczacılık Bileşim Akreditasyon Kurulu tarafından onaylandığı için bileşik siklofosfamid ve piroksikam tedarikçisi olarak seçilmiştir. Bununla birlikte, karışımların yanlışlıkla aşırı dozda veya eksik dozda verilmesinin bazı hastalarda sırasıyla toksisite artışı veya terapötik altı ilaç konsantrasyonları ile sonuçlanabileceği kabul edilmektedir.

Mevcut çalışmanın potansiyel olarak zayıf noktası, metronomik tedavi rejiminin karboplatin kemoterapisinin tamamlanmasından sonra başlamış olmasıdır. Bu durum, kalan mikroskobik metastatik tümör hücrelerine çoklu tedavilere karşı direnç geliştirmeleri için zaman kazandırmış ve böylece sonraki tedavinin olası etkilerini ortadan kaldırmış olabilir. Apendiküler osteosarkomlu köpeklerde karboplatin ile eş zamanlı olarak uygulanan metronomik siklofosfamid ve piroksikam kullanımının başka bir çalışmada iyi tolere edildiği rapor edilirken [50], eş zamanlı uygulama ile sağkalım süresinde herhangi bir iyileşme kaydedilmemiştir. Bununla birlikte, toceranibin metronomik kemoterapi ve karboplatin ile birlikte eş zamanlı kullanımının DFI ve OS’yi önemli ölçüde etkileyip etkilemediğini belirlemek gerekebilir.

Sonuç

Yaygın olarak kullanılan metronomik kemoterapi protokolüne toceranib eklenmesi, amputasyon ve karboplatin kemoterapisinden sonra apendiküler OSA’lı köpeklerde DFI, OS ve 1 yıllık sağkalım oranlarını tek başına metronomik tedaviye kıyasla iyileştirememiştir. Ayrıca, bu çalışmadaki DFI, OS ve 1 yıllık sağkalım oranları, daha önce OSA’lı köpeklere tek başına amputasyon ve karboplatin kemoterapi tedavisi uygulandığında bulunanlarla benzerlik göstermiştir. Bu çalışma, tümör mikroçevresine karşı aktiviteyi optimize etmeyi amaçlayan yeni yaklaşımların başarılı bir şekilde kullanılabilmesi için hastalığın çeşitli aşamalarında görülen tümör ilerlemesini yönlendiren moleküler mekanizmaların kapsamlı bir şekilde incelenmesi gerektiğinin altını çizmektedir.

Ek Bilgi

S1 Tablosu. Yan Etki Oranları (sayı/30 gün) ve Oran Rasyoları (RR’ler). Tablo yalnızca en az beş hastanın ve her tedavi grubunda en az iki hastanın yaşadığı olayları içermektedir. (DOCX)

Teşekkürler

Ohio Devlet Üniversitesi Veteriner Hekimlik Fakültesi Klinik Araştırmalar Ofisi (CTO) (Nicole Stingle, Tamra Mathie, Ashley Smith) vaka rapor formlarının oluşturulması, numunelerin toplanması, verilerin harmanlanması, kalite güvencesi, diğer klinik sahaların koordinasyonu ve tüm çalışma sahalarından gelen tüm veriler üzerinde nihai kalite kontrolü dahil olmak üzere bu çalışmanın tüm yönlerini koordine etmiştir. Bu proje Translasyonel Bilimler Gelişim Ulusal Merkezi’nden UL1TR001070 ve Ulusal Kanser Enstitüsü’nden Ohio Eyalet Üniversitesi’ne P30CA016058 numaralı fonlar ile desteklenmiştir. Bu klinik çalışma için finansman Zoetis tarafından sağlanmıştır. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Translasyonel Bilimler Gelişim Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Zoetis’in resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Katkıda Bulunan Yazarlar

Deneyleri tasarlayan ve düzenleyen: CAL. Deneyleri gerçekleştiren: CAL HLG RP MLP CAC MPR DMV LEW KLC HW-R AB CJH DBB JL NCN MC-J VLG MKK DMR DHT BP GP. Verileri analiz eden: CAL HLG MLP. Reaktif / malzeme / analiz araçlarına katkıda bulunanlar: MLP. Makaleyi yazan: CAL HLG MLP. Veri girişini organize eden ve kalite kontrolünü yapan: TM NS.

Kaynakça

1. Ehrhart NP, Ryan SD, Fan Tumors of the Skeletal System. In: Withrow SJ, MacEwen EG, Page RL, editors. Small Animal Clinical Oncology. 5 ed. St. Louis: W B Saunders Co; 2013. pp. 463–503.

2. Spodnick GJ, Berg J, Rand WM, Schelling SH, Couto G, Harvey J, et Prognosis for dogs with appendicular osteosarcoma treated by amputation alone: 162 cases (1978–1988). JAVMA. 1992; 200: 995– 999. PMID: 1577656

3. Bergman PJ, MacEwen EG, Kurzman ID, Henry CJ, Hammer AS, Knapp DW, et Amputation and carboplatin for treatment of dogs with osteosarcoma: 48 cases (1991 to 1993). J Vet Intern Med. 1996 Mar; 10(2):76–81. PMID: 8683484

4. Chun R, Kurzman ID, Couto CG, Klausner J, Henry C, MacEwen Cisplatin and doxorubicin combi- nation chemotherapy for the treatment of canine osteosarcoma: a pilot study. J Vet Intern Med. 2000 Sep; 14(5):495–8. PMID: 11012111

5. Kent MS, Strom A, London CA, Seguin Alternating carboplatin and doxorubicin as adjunctive chemo- therapy to amputation or limb-sparing surgery in the treatment of appendicular osteosarcoma in dogs. J Vet Intern Med. 2004 Jul; 18(4):540–4. PMID: 15320595

6. Moore AS, Dernell WS, Ogilvie GK, Kristal O, Elmslie R, Kitchell B, et Doxorubicin and BAY 12– 9566 for the treatment of osteosarcoma in dogs: a randomized, double-blind, placebo-controlled study. J Vet Intern Med. 2007 Jul; 21(4):783–90. PMID: 17708400

7. Phillips B, Powers BE, Dernell WS, Straw RC, Khanna C, Hogge GS, et Use of single-agent carbo- platin as adjuvant or neoadjuvant therapy in conjunction with amputation for appendicular osteosarco- ma in dogs. Journal of the American Animal Hospital Association. 2009 Jan; 45(1):33–8. PMID: 19122062

8. Selmic LE, Burton JH, Thamm DH, Withrow SJ, Lana Comparison of carboplatin and doxorubicin- based chemotherapy protocols in 470 dogs after amputation for treatment of appendicular osteosarco- ma. J Vet Intern Med. 2014 Mar; 28(2):554–63. doi: 10.1111/jvim.12313 PMID: 24512451

9. Elmslie RE, Glawe P, Dow Metronomic therapy with cyclophosphamide and piroxicam effectively delays tumor recurrence in dogs with incompletely resected soft tissue sarcomas. J Vet Intern Med. 2008 Nov; 22(6):1373–9. doi: 10.1111/j.1939-1676.2008.0179.x PMID: 18976288

10. Lana S, U’ren L, Plaza S, Elmslie R, Gustafson D, Morley P, et Continuous low-dose oral chemother- apy for adjuvant therapy of splenic hemangiosarcoma in dogs. J Vet Intern Med. 2007 Jul; 21(4):764–9. PMID: 17708397

11. Burton JH, Mitchell L, Thamm DH, Dow SW, Biller Low-dose cyclophosphamide selectively de- creases regulatory T cells and inhibits angiogenesis in dogs with soft tissue sarcoma. J Vet Intern Med. 2011 Jul; 25(4):920–6. doi: 10.1111/j.1939-1676.2011.0753.x PMID: 21736624

12. Ghiringhelli F, Menard C, Puig PE, Ladoire S, Roux S, Martin F, et Metronomic cyclophosphamide regimen selectively depletes CD4+CD25+ regulatory T cells and restores T and NK effector functions in end stage cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 2007 May; 56(5):641–8. PMID: 16960692

13. Bertolini F, Paul S, Mancuso P, Monestiroli S, Gobbi A, Shaked Y, et Maximum tolerable dose and low-dose metronomic chemotherapy have opposite effects on the mobilization and viability of circulat- ing endothelial progenitor cells. Cancer Research. 2003 Aug 1; 63(15):4342–6. PMID: 12907602

14. Browder T, Butterfield CE, Kräling BM, Shi B, Marshall B, O’Reilly MS, et Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer. Cancer Research. 2000 Apr 1; 60(7):1878–86. PMID: 10766175

15. Colleselli D, Bijuklic K, Mosheimer BA, Kähler Inhibition of cyclooxygenase (COX)-2 affects endo- thelial progenitor cell proliferation. Exp Cell Res. 2006 Sep 10; 312(15):2933–41. PMID: 16893539

16. Choisunirachon N, Jaroensong T, Yoshida K, Saeki K, Mochizuki M, Nishimura R, et Effects of low- dose cyclophosphamide with piroxicam on tumour neovascularization in a canine oral malignant mela- noma-xenografted mouse model. Veterinary and Comparative Oncology. 2013 Jul 26; InPress.

17. Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T, et Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997 Feb 14; 275(5302):964–7. PMID: 9020076

18. Lyden D, Hattori K, Dias S, Costa C, Blaikie P, Butros L, et Impaired recruitment of bone-marrow-de- rived endothelial and hematopoietic precursor cells blocks tumor angiogenesis and growth. Nat Med. 2001 Nov; 7(11):1194–201. PMID: 11689883

19. Stoelting S, Trefzer T, Kisro J, Steinke A, Wagner T, Peters Low-dose oral metronomic chemother- apy prevents mobilization of endothelial progenitor cells into the blood of cancer patients. in vivo. 2008 Nov; 22(6):831–6. PMID: 19181016

20. Willett CG, Boucher Y, di Tomaso E, Duda DG, Munn LL, Tong RT, et Direct evidence that the VEGF-specific antibody bevacizumab has antivascular effects in human rectal cancer. Nat Med. 2004 Feb; 10(2):145–7. PMID: 14745444

21. Kaya M, Wada T, Akatsuka T, Kawaguchi S, Nagoya S, Shindoh M, et Vascular endothelial growth factor expression in untreated osteosarcoma is predictive of pulmonary metastasis and poor prognosis. Clin Cancer Res. 2000 Feb; 6(2):572–7. PMID: 10690541

22. Ohba T, Cates JMM, Cole HA, Slosky DA, Haro H, Ando T, et Autocrine VEGF/VEGFR1 signaling in a subpopulation of cells associates with aggressive osteosarcoma. Mol Cancer Res. 2014 Aug; 12 (8):1100–11. doi: 10.1158/1541-7786.MCR-14-0037 PMID: 24759089

23. Yang J, Yang D, Sun Y, Sun B, Wang G, Trent JC, et Genetic amplification of the vascular endotheli- al growth factor (VEGF) pathway genes, including VEGFA, in human osteosarcoma. Cancer. 2011 Nov 1; 117(21):4925–38. doi: 10.1002/cncr.26116 PMID: 21495021

24. Thamm DH, O’Brien MG, Vail Serum vascular endothelial growth factor concentrations and post- surgical outcome in dogs with osteosarcoma. Veterinary and Comparative Oncology. 2008 Jun; 6 (2):126–32. doi: 10.1111/j.1476-5829.2007.00153.x PMID: 19178672

25. Wergin MC, Kaser-Hotz Plasma vascular endothelial growth factor (VEGF) measured in seventy dogs with spontaneously occurring tumours. in vivo. 2004 Jan; 18(1):15–9. PMID: 15011746

26. García-Sáenz JA, Martín M, Calles A, Bueno C, Rodríguez L, Bobokova J, et Bevacizumab in com- bination with metronomic chemotherapy in patients with anthracycline- and taxane-refractory breast cancer. J Chemother. 2008 Oct; 20(5):632–9. PMID: 19028628

27. Klement G, Baruchel S, Rak J, Man S, Clark K, Hicklin DJ, et Continuous low-dose therapy with vin- blastine and VEGF receptor-2 antibody induces sustained tumor regression without overt toxicity. J Clin Invest. 2000 Apr; 105(8):R15–24. PMID: 10772661

28. Pàez-Ribes M, Allen E, Hudock J, Takeda T, Okuyama H, Viñals F, et Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and distant metastasis. Cancer Cell. 2009 Mar 3; 15(3):220–31. doi: 10.1016/j.ccr.2009.01.027 PMID: 19249680

29. Ebos JML, Lee CR, Cruz-Munoz W, Bjarnason GA, Christensen JG, Kerbel Accelerated metasta- sis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis. Cancer Cell. 2009 Mar 3; 15 (3):232–9. doi: 10.1016/j.ccr.2009.01.021 PMID: 19249681

30. Maris JM, Courtright J, Houghton PJ, Morton CL, Gorlick R, Kolb EA, et Initial testing of the VEGFR inhibitor AZD2171 by the pediatric preclinical testing program. Pediatr Blood Cancer. 2008 Mar; 50 (3):581–7. PMID: 17457854

31. Pignochino Y, Grignani G, Cavalloni G, Motta M, Tapparo M, Bruno S, et Sorafenib blocks tumour growth, angiogenesis and metastatic potential in preclinical models of osteosarcoma through a mecha- nism potentially involving the inhibition of ERK1/2, MCL-1 and ezrin pathways. Mol Cancer. 2009; 8 (1):118.

32. van Cruijsen H, Voest EE, Punt CJA, Hoekman K, Witteveen PO, Meijerink MR, et Phase I evalua- tion of cediranib, a selective VEGFR signalling inhibitor, in combination with gefitinib in patients with ad- vanced tumours. Eur J Cancer. 2010 Mar; 46(5):901–11. doi: 10.1016/j.ejca.2009.12.023 PMID: 20061136

33. London CA, Hannah AL, Zadovoskaya R, Chien MB, Kollias-Baker C, Rosenberg M, et Phase I dose-escalating study of SU11654, a small molecule receptor tyrosine kinase inhibitor, in dogs with spontaneous malignancies. Clin Cancer Res. 2003 Jul; 9(7):2755–68. PMID: 12855656

34. Mendel DB, Laird AD, Xin X, Louie SG, Christensen JG, Li G, et In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-de- rived growth factor receptors: determination of a pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship. 2003 Jan; 9(1):327–37. PMID: 12538485

35. Pryer NK, Lee LB, Zadovaskaya R, Yu X, Sukbuntherng J, Cherrington JM, et Proof of target for SU11654: inhibition of KIT phosphorylation in canine mast cell tumors. Clin Cancer Res. 2003 Nov 15; 9(15):5729–34. PMID: 14654558

36. London CA, Malpas PB, Wood-Follis SL, Boucher JF, Rusk AW, Rosenberg MP, et Multi-center, pla- cebo-controlled, double-blind, randomized study of oral toceranib phosphate (SU11654), a receptor ty- rosine kinase inhibitor, for the treatment of dogs with recurrent (either local or distant) mast cell tumor following surgical excision. Clin Cancer Res. 2009 Jun 1; 15(11):3856–65. doi: 10.1158/1078-0432. CCR-08-1860 PMID: 19470739

37. Bernabe LF, Portela R, Nguyen S, Kisseberth WC, Pennell M, Yancey MF, et Evaluation of the ad- verse event profile and pharmacodynamics of toceranib phosphate administered to dogs with solid tu- mors at doses below the maximum tolerated dose. BMC Vet Res. 2013; 9(1):190.

38. London C, Mathie T, Stingle N, Clifford C, Haney S, Klein MK, et Preliminary evidence for biologic activity of toceranib phosphate (Palladia) in solid tumours. Veterinary and Comparative Oncology. 2012 Sep; 10(3):194–205. doi: 10.1111/j.1476-5829.2011.00275.x PMID: 22236194

39. Mitchell L, Thamm DH, Biller BJ. Clinical and immunomodulatory effects of toceranib combined with low-dose cyclophosphamide in dogs with J Vet Intern Med. 2012 Mar; 26(2):355–62. doi: 10. 1111/j.1939-1676.2011.00883.x PMID: 22303814

40. Krzyzanowska MK, Tannock IF, Lockwood G, Knox J, Moore M, Bjarnason A phase II trial of con- tinuous low-dose oral cyclophosphamide and celecoxib in patients with renal cell carcinoma. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 2007 Jun; 60(1):135–41. PMID: 17009033

41. Stempak D, Gammon J, Halton J, Moghrabi A, Koren G, Baruchel A pilot pharmacokinetic and anti- angiogenic biomarker study of celecoxib and low-dose metronomic vinblastine or cyclophosphamide in pediatric recurrent solid tumors. J Pediatr Hematol Oncol. 2006 Nov; 28(11):720–8. PMID: 17114958

42. Dellapasqua S, Bertolini F, Bagnardi V, Campagnoli E, Scarano E, Torrisi R, et Metronomic cyclo- phosphamide and capecitabine combined with bevacizumab in advanced breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 2008 Oct 20; 26(30):4899–905. doi: 10.1200/JCO.2008.17.4789 PMID: 18794539

43. Veterinary Co-operative Oncology Group (VCOG). Veterinary Co-operative Oncology Group—Com- mon Terminology Criteria for Adverse Events (VCOG-CTCAE) following chemotherapy or biological antineoplastic therapy in dogs and cats 0. Veterinary and Comparative Oncology. 2004 Dec; 2 (4):195–213. doi: 10.1111/j.1476-5810.2004.0053b.x PMID: 19379294

44. Schoenfeld Partial residuals for the proportional hazards regression model. Biometrika. 1982; 69:239–241.

45. Grambsch PM, Therneau Proportional hazards tests and diagnostics based on weighted residuals. Biometrika. 1994; 81:515–526.

46. Fenger JM, London CA, Kisseberth Canine osteosarcoma: a naturally occurring disease to inform pediatric oncology. ILAR J. Oxford University Press; 2014; 55(1):69–85. doi: 10.1093/ilar/ilu009 PMID: 24936031

47. Bailey D, Erb H, Williams L, Ruslander D, Hauck Carboplatin and doxorubicin combination chemo- therapy for the treatment of appendicular osteosarcoma in the dog. J Vet Intern Med. 2003 Mar; 17 (2):199–205. PMID: 12683621

48. Chun R, Garrett LD, Henry C, Wall M, Smith A, Azene Toxicity and efficacy of cisplatin and doxoru- bicin combination chemotherapy for the treatment of canine osteosarcoma. Journal of the American Animal Hospital Association. 2005 Nov; 41(6):382–7. PMID: 16267062

49. McMahon M, Mathie T, Stingle N, Romansik E, Vail D, London Adjuvant carboplatin and gemcitabine combination chemotherapy postamputation in canine appendicular osteosarcoma. J Vet Intern Med. 2011 May; 25(3):511–7. doi: 10.1111/j.1939-1676.2011.0697.x PMID: 21488959

50. Bracha S, Walshaw R, Danton T, Holland S, Ruaux C, Obradovich Evaluation of toxicities from com- bined metronomic and maximal-tolerated dose chemotherapy in dogs with osteosarcoma. J Small Ani- mal Practice. 2014 Jul; 55(7):369–74. doi: 10.1111/jsap.12228 PMID: 24803081

51. Leach TN, Childress MO, Greene SN, Mohamed AS, Moore GE, Schrempp DR, et Prospective trial of metronomic chlorambucil chemotherapy in dogs with naturally occurring cancer. Veterinary and Comparative Oncology. 2012 Jun; 10(2):102–12. doi: 10.1111/j.1476-5829.2011.00280.x PMID: 22236329

52. Singh M, Couto SS, Forrest WF, Lima A, Cheng JH, Molina R, et Anti-VEGF antibody therapy does not promote metastasis in genetically engineered mouse tumour models. The Journal of Pathology. 2012 Aug; 227(4):417–30. doi: 10.1002/path.4053 PMID: 22611036

53. Gaeta R, Brown D, Cohen R, Sorenmo Risk factors for development of sterile haemorrhagic cystitis in canine lymphoma patients receiving oral cyclophosphamide: a case-control study. Veterinary and Comparative Oncology. 2014 Dec; 12(4):277–86. doi: 10.1111/vco.12009 PMID: 23078083

54. Saam DE, LIPTAK JM, Stalker MJ, Chun Predictors of outcome in dogs treated with adjuvant carbo- platin for appendicular osteosarcoma: 65 cases (1996–2006). J Am Vet Med Assoc. 2011 Jan 15; 238 (2):195–206. doi: 10.2460/javma.238.2.195 PMID: 21235373

55. Schmidt AF, Nielen M, Klungel OH, Hoes AW, de Boer A, Groenwold RHH, et Prognostic factors of early metastasis and mortality in dogs with appendicular osteosarcoma after receiving surgery: an indi- vidual patient data meta-analysis. Preventive Veterinary Medicine. 2013 Nov 1; 112(3–4):414–22. doi: 10.1016/j.prevetmed.2013.09.010 PMID: 24128755

56. Kuntz CA, Asselin TL, Dernell Limb salvage surgery for osteosarcoma of the proximal humerus: outcome in 17 dogs. Veterinary Surgery. 1998; 27:417–422. PMID: 9749511

57. Boerman I, Selvarajah GT, Nielen M, Kirpensteijn Prognostic factors in canine appendicular osteo- sarcoma—a meta-analysis. BMC Vet Res. 2012; 8(1):56.

58. Sacornrattana O, Dervisis NG, McNiel Abdominal ultrasonographic findings at diagnosis of osteo- sarcoma in dogs and association with treatment outcome. 2013 Sep; 11(3):199–207.

59. Wallace M, Selmic L, Withrow Diagnostic utility of abdominal ultrasonography for routine staging at diagnosis of skeletal OSA in dogs. Journal of the American Animal Hospital Association. American Ani- mal Hospital Association; 2013 Jul; 49(4):243–5. doi: 10.5326/JAAHA-MS-5862 PMID: 23690490

60. Jankowski MK, Steyn PF, Lana SE, Dernell WS, Blom CM, Uhrig JL, et Nuclear scanning with 99mTc-HDP for the initial evaluation of osseous metastasis in canine osteosarcoma. Veterinary and Comparative Oncology. 2003 Sep; 1(3):152–8. doi: 10.1111/j.1476-5829.2003.00021.x PMID: 19379314