Miluse Vozdova (1), Svatava Kubickova (1), Petr Fictum (2), Jan Fröhlich (1), Frantisek Jelinek (3), Jiri Rubes (1)
1. Central European Institute of Technology-Veterinary Research Institute, Hudcova 70, 621 00 Brno, Czech Republic
2. Department of Pathological Morphology and Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Palackeho tr. 1946/1, 612 42 Brno, Czech Republic
3. Veterinary Pathology, Veterinary Histopathological Laboratory, Sojovicka 16, 197 00 Prag, Czech Republic
Özet
Kutanöz mast hücreli tümörler (MCT) köpeklerde en sık görülen maligniteler arasındadır. Klinik davranışları oldukça değişkendir ve c-kit genindeki mutasyonlar hariç, genetik etiyolojileri hakkında çok az şey bilinmektedir. C-kitinin 8, 9 ve 11 ekzonlarının mutasyonel durumu ve TP53 geninin 5–8 ekzonları, MCT’lerin moleküler tabakalaşmasının/katmanlaşmasının işaretlerini ve klinik sonucun belirleyicilerini bulmak için analiz edildi. C-kit genindeki mutasyonlar %19.5 (n = 8/41) numunelerde tespit edildi ve bunların varlığı yüksek histopatolojik dereceyle anlamlı derecede ilişkiliydi (P = 0.038). TP53 geninin DNA bağlama alanındaki mutasyonlar, analiz edilen MCT’lerin % 4.6’sında (n = 6/41) bulundu ve bunların sıklığı düşük ve yüksek dereceli MCT’lerde benzerdi (P> 0.05). TP53 mutasyonları, köpek kutanöz MCT’lerin bu örneğinde faydalı prognostik faktörler değildi.
Köpek kütanöz MCT’leri, yüksek mortalite oranlarıyla ilişkili, iyi huyludan agresif olana kadar klinik davranış gösteren cilt neoplazmalarıdır. Köpek kutanöz MCT’lerinde prognostik, çoğunlukla 3- veya 2 aşamalı derecelendirme sistemleri kullanan klinik evreleme ve histopatolojik derecelendirmeye dayanır. (Patnaik vd., 1984; Kiupel vd., 2011). Ayrıca, c-kit geninin 8, 9 ve 11. ekzonlarındaki mutasyonlar, kutanöz MCT’li köpeklerde tekrarlayan hastalık ve ölüm riski artışı ile ilişkilendirilmiştir. (Webster vd., 2006; Letard vd., 2008; Takeuchi vd., 2013). Bununla birlikte, çoğu köpek kutanöz MCT’lerinde c-kit mutasyonları yoktur (Letard vd., 2008). Bu nedenle, prognostik kriterleri geliştirmek için yeni tanısal göstergelere ve tanısal ve terapötik kılavuzlara ihtiyaç duyulur. TP53, hücre proliferasyonunun/çoğalmasının, genomik stabilitenin/dayanıklılığın ve programlanmış hücre ölümünün düzenlenmesinde merkezi bir rol oynayan tümör baskılayıcı bir gendir. TP53 genindeki, esas olarak DNA bağlama alanındaki (eksonlar 5-8) mutasyonlar, çeşitli insan ve köpek tümörlerinde tarif edilmiştir. (Bouaoun vd., 2016; Asada et al., 2017). TP53 proteini, köpek MCT’leri üzerindeki immünohistokimyasal yöntemler kullanılan bir çalışmada örneklerin neredeyse yarısında tespit edildi. (Ginn vd., 2000). Bununla birlikte, başka bir köpek MCT numunesi çalışmasında TP53 mutasyon durumunun analizi, TP53 mutasyonunun sadece bir vakada tespit edildi. (Kanaya vd., 2002).
Bu çalışmada, c-kit geninin 8, 9 ve 11 eksonlarını ve köpek kutanöz MCT’lerinde TP53 geninin 5–8 ekzonlarını analiz ettik. Hipotezimiz, bu genlerdeki mutasyonların, MCT’lerin moleküler tabakalaşmasında ve klinik sonuçların tahmininde genetik göstergeler olarak işlev görebileceği yönündeydi.
Toplam 41 formalin sabit parafine gömülmüş MCT örneği analize dahil edildi. Cerrahi toplama işlemi genel anestezi altında deneyimli veteriner cerrahlar tarafından yapıldı. Tümörler 3 cm marj ile eksize edildi ve cerrahi sonrası mikrometastazları yok etmeye yönelik yardımcı tedavi ygulanmadı. Kutanöz MCT’nin tanısal teyidi deneyimli bir histopatolog tarafından yapıldı. Çalışmaya alınan köpeklerin özellikleri Tablo 1’de sunulmuştur. DNA, BiOstic FFPE Doku DNA İzolasyon Kiti (MOBIO Laboratories) kullanılarak izole edildi ve MinElute PCR Saflaştırma Kiti (Qiagen) ile saflaştırıldı. C-kit geninin 8, 9 ve 11 eksonlarının ve TP53 geninin 5–8 eksonlarının PCR amplikonları, Hot Start Combi PPP Master Mix (Top-Bio) ve spesifik primerler/öncüller (Ek Tablo S1) kullanılarak elde edildi. PCR sonuçları sekanslandı.
Örneklerin 19.5’inde C-kit geninde değişiklikler (n = 8/41) ve %14.6’sında TP53 mutasyonları tespit edildi (n = 6/ 41; Tablo 2). C-kit mutasyonları, hatalı substitüsyonlar/ ikameler (% 62,5) ve dahili tandem kopyalar (ITD’ler,% 37,5) içeriyordu. Ekson 11 en sık değiştirilendi. Bu daha önce yayınlanmış verilerle uyuşuyor (Webster vd., 2006; Letard vd., 2008; Takeuchi vd., 2013). Bu çalışmada tespit edilen sekiz c-kit mutasyonundan üçü daha önce köpek kutanöz MCT’lerinde tarif edilmiştir: ITD417-421, ITD576-590 ve p.Asn508Ille (Letard vd., 2008; Takeuchi vd.,2013). Yanlış anlam mutasyonu P.Ser479Gly, daha önce yayınlandığı gibi p.Ser479Ile substitüsyonu ile aynı kodonda tespit edildi ve ITD574-590, ITD’lerden sıkça etkilenen bir bölgede bulundu. (Letard et al., 2008).
Bu örnek deri kutanöz MCT setindeki nispeten düşük c-kit mutasyon sıklığı, MCT gelişiminde rol alan tek faktör olmadıklarını gösterir. Çeşitli insan ve köpek kanserleri arasındaki ortaklık ve TP53 genindeki alterasyon bilinmekte (Bouaoun vd., 2016; Asada vd., 2017). TP53 proteininin immünohistokimyasal tespiti üzerine odaklanan çalışmalar, köpek kütanoz MCT’lerin %47’sine kadar TP53 pozitifliği olduğunu bildirmiştir (Ginn vd., 2000). Bununla birlikte, TP53 genindeki sadece bir mutasyon vakası daha önce köpek MCT’lerinde tespit edildi (Kanaya vd., 2002), immünohistokimyasal saptamanın insan kanserlerinde daha önce bildirildiği gibi doğrudan DNA mutasyon durumunu yansıtmayabileceğini gösterdi (Benjamin vd.,1996). Bouaoun vd. (2016) tarafından yapılan bir çalışmada TP53 değişikliklerinin %80’ini içerdiği bildirilen 5-8 eksonlarını analiz ettik; bizim çalışmamızda MCT’lerin %14,6’ünde mutasyon vardı. Çalışmamızda tespit edilen altı yanlış anlam mutasyonundan dördü, insan IARC TP53 veritabanındaki (Bouaoun vd., 2016; ver. R19, Kasım 2018) “toleranttan intolerantı ayırma” (SIFT-Sorting intolerant from tolerant) zararlı/deleteriyöz mutasyonlar olarak kaydedilen subtitüsyonlarla aynıydı. Bizim köpek p.P138S’miz insan p.P151S’e denktir; köpek p.G214V, insan G226V’ye, köpek p.I220T insan p.232T’ye ; ve insan p.S241F, köpek s. 229F’ye karşılık gelir (Bouaoun vd., 2016).
Pearson iki değişkenli korelasyon testini kullanarak c-kit ve TP53 mutasyon durumu ile köpek ve tümör özellikleri arasındaki olası ilişkileri analiz ettik (SPSS yazılım paketi, Windows için sürüm 18). Daha önce bildirildiği gibi c-kit mutasyonları ile yüksek histopatolojik dereceli (Kiupel; P = 0.038) arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki vardı (Webster et al., 2006; Takeuchi et al., 2013). Bununla birlikte, yüksek dereceli durum ile sağkalım süresi arasında anlamlı bir negatif korelasyon olmasına rağmen (Kiupel, P <0.001, r = 0.661; Patnaik, P <0.003, r = 0.455), c-kit mutasyonlarının varlığı ve hayatta kalma süresi arasında anlamlı bir ilişki görülmedi (P = 0.590, r = 0.087). Verilerimiz TP53 mutasyonlarının varlığı ile tümör derecesi arasında korelasyon göstermedi ve TP53 mutasyonları sağkalım süresini önemli ölçüde azaltmadı (P = 0.823, r = 0.036). Operasyondan, kanser sebebiyle ölüme kadar olan süreyi karşılaştırmak için Kaplan-Meier sağkalım eğrileri (Log-Rank) kullanmak suretiyle de benzer sonuçlar elde edilmiştir (Şekil 1). Bu çalışmada sağkalım süresi ile c-kit ve TP53 mutasyonları arasında anlamlı korelasyon olmamasının sebebi, halen hayatta olan bazı köpeklerin tümör ameliyatından bu yana nispeten kısa bir süre geçmesiyle ilişkili olabilir. Sonuçlarımız TP53 proteininin immünohistokimyasal tespitini araştıran daha önceki bir çalışmayla uyuşmakta. TP53 immünoreaktivitesi, köpek MCT’lerinde tümör nüks süresi veya sağkalım süreleriyle ilişkili değildi (Ginn vd., 2000).
Köpek kutanöz MCT’lerine dair bu çalışmada TP53 gen mutasyonları gösterilmiştir. Ancak, bunların varlığı bu örnek sette prognoz ile ilişkili değildi.
Menfaat çatışması bildirimi
Yazarların hiçbiri makalenin içeriğini uygunsuz şekilde etkileyebilecek veya önyargılı olabilecek başka herhangi bir finansal veya kişisel ilişkiye sahip değildir.
Teşekkür
Bu çalışma Çek Bilim Vakfı’nın (GA CR) 16-26655S, Çek Cumhuriyeti Tarım Bakanlığı’nın (RO 0518) hibeleri ve Çek Cumhuriyeti Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı’nın CEITEC 2020 (LQ1601) projesi ile desteklenmiştir. Yazarlar, köpek sahiplerine ve analiz için tümör örnekleri toplayan veterinerlere müteşekkirdir.
Ek veriler
Bu makaleyle ilgili ek malzemeler için: https://doi.org/10.1016/j.tvjl.2019.03.005
Referanslar
* Asada, H., Tsuboi, M., Chambers, J.K., Uchida, K., Tomiyasu, H., Goto-Koshino, Y., Ohno, K., Tsujimoto, H., 2017. A 2-base insertion in exon 5 is a common mutation of the TP53 gene in dogs with histiocytic sarcoma. The Journal of Veterinary Medical Science 79, 1721–1726.
* Benjamin, I., Saigo, P., Finstad, C., Takahashi, H., Federic, M., Rubin, S.C., Boyd, J., 1996. Expression and mutational analysis of P53 in stage IB and IIA cervical cancers. American Journal of Obstetrics and Gynecology 175, 1266–1271.
* Bouaoun, L., Sonkin, D., Ardin, M., Hollstein, M., Byrnes, G., Zavadil, J., Olivier, M., 2016. TP53 variations in human cancers: new lessons from the IARC TP53 database and genomics data. Human Mutation 37, 865–876.
* Ginn, P.E., Fox, L.E., Brower, J.C., Gaskin, A., Kurzman, I.D., Kubilis, P.S., 2000. Immunohistochemical detection of p53 tumor-suppressor protein is a poor indicator of prognosis for canine cutaneous mast cell tumors. Veterinary Pathology 37, 33–39.
* Kanaya, N., Okuda, M., Toyama, N., Oikawa, T., Inokuma, H., Morimoto, M., Hayashi, T., Une, S., Nakaichi, M., Taura, Y., et al., 2002. Detection of the anti-P53 antibodies in dogs with tumors. The Journal of Veterinary Medical Science 64, 973–979.
* Kiupel, M., Webster, J.D., Bailey, K.L., Best, S., DeLay, J., Detrisac, C.J., Fitzgerald, S.D., Gamble, D., Ginn, P.E., Goldschmidt, M.H., et al., 2011. Proposal of a 2-tier histologic grading system for canine cutaneous mast cell tumors to more accurately predict biological behavior. Veterinary Pathology 48, 147–155.
* Letard, S., Yang, Y., Hanssens, K., Palmérini, F., Leventhal, P.S., Guéry, S., Moussy, A., Kinet, J.-P., Hermine, O., Dubreuil, P., 2008. Gain-of-function mutations in the extracellular domain of KIT are common in canine mast cell tumors. Molecular Cancer Research 6, 1137–1145.
* Patnaik, A.K., Ehler, W.J., MacEwen, E.G., 1984. Canine cutaneous mast cell tumor: morphologic grading and survival time in 83 dogs. Veterinary Pathology 21, 469–474.
* Takeuchi, Y., Fujino, Y., Watanabe, M., Takahashi, M., Nakagawa, T., Takeuchi, A., Bonkobara, M., Kobayashi, T., Ohno, K., Uchida, K., et al., 2013. Validation of the prognostic value of histopathological grading or c-kit mutation in canine cutaneous mast cell tumours: a retrospective cohort study. Veterinary Journal 196, 492–498.
* Webster, J.D., Yuzbasiyan-Gurkan, V., Kaneene, J.B., Miller, R., Resau, J.H., Kiupel, M., 2006. The role of c-KIT in tumorigenesis: evaluation in canine cutaneous mast cell tumors. Neoplasia 8, 104–111.
