Veteriner Hekimlikte Kanser İçin İmmünoterapi Stratejisi Olarak Elektroporasyon: Latin Amerika’da Son Teknoloji

1. Giriş
Veteriner hekimliği, sahipleri evcil hayvanlarına daha iyi bakmayı amaçladıkça sürekli olarak gelişmektedir. Evcil hayvanlar birçok ailenin hayati bir bileşeni haline gelmiştir ve son yıllarda tedavilerindeki harcamalar giderek artmaktadır.^[1] Geçmişte, veteriner hekimler herhangi bir hastalığı herhangi bir ayrım yapmadan tedavi ettiler, ancak son zamanlarda bazıları belirli alanlarda uzmanlaştı ve insan tıbbında var olanlar gibi veterinerlik alanında çeşitli tıbbi uzmanlıkların gelişmesine yol açtı. Günümüzde veteriner onkolojisi, birçok ülkede insan muadilinden daha gelişmiş olan çok gelişmiş bir alandır. Örneğin, Latin Amerika’da, elektrokemoterapi (ECT) birçok ülkede veterinerlik tıbbında mevcuttur, ancak insan tıbbında mevcut değildir.
ECT, bleomisin veya sisplatin için hücre zarı geçirgenliğini arttırmak için bir elektrik alanının uygulanmasından oluşan bir kanser tedavisidir. İlk olarak 1991’de Mir ve ark.^[2] tarafından tanımlandı ve ilk klinik çalışma aynı yıl daha sonra yayınlandı.^[3] 2006 yılında, bu teknik için standart ameliyat prosedürleri yayınlandığında ve Kliniporatör (IGEA, Carpı, İtalya) insan kullanımı için onaylandığında, kanser hastalarının palyatif tedavisi için değerli bir seçenek haline geldi.
Hücrelere sisplatin veya bleomisin enjekte etmek için elektrik alanları kullanmadan önce, genleri enjekte etmek ve gen Elektrotransfer (GET) adı verilen bir teknik kullanarak ekspresyonlarını arttırmak için kullanıldılar. İlk olarak 1982’de Neumann ve ark.^[4] tarafından tanıtıldı ve gen transfeksiyonu için basit, kolay uygulanabilir ve etkili bir yöntem olarak tanımladı. Daha önce keşfedilmesine rağmen, GET hala deneysel bir terapidir, ECT ise hem insan hem de veterinerlik tıbbında seçilmiş hastalar için bir bakım standardıdır.
Son zamanlarda, kalsiyum elektroporasyonunun gelişimi, sisplatin veya bleomisinin kalsiyum ile değiştirilmesine izin vermiştir. Ana endikasyonu, önceki ilaçların kullanılmasının mümkün olmadığı zamandır, ancak seçiciliği korumasına rağmen, daha az etkilidir.^[5]
Bu teknikler ortak bir özelliği paylaşırlar, hücreyi koruyacak boyutta zarında geçici bir gözenek oluşumunu provoke ederler. Aksine, başka bir elektroporasyona dayalı teknik olan geri dönüşümsüz elektroporasyon (IRE), uzun gözenek kapanma sürelerini indükler ve homeostazına geri dönüşü olmayan hasar ile hücre ölümüne yol açar.^[6] Geri dönüşümlü veya geri dönüşümsüz elektroporasyon yapmak, uygulanan elektriksel vuruş parametrelerine bağlıdır.
Biyomedikal uygulamalar için elektroporasyona dayalı tedavilerin yüksek yanıt oranı, onları hem insan hem de veterinerlik tıbbında onkolojide giderek daha fazla kullanılan bir terapötik prosedür haline getirmiştir. Tedaviler her durumda oldukça basit olmasına rağmen, başarıları çeşitli faktörlere bağlıdır: İlk olarak, kullanılan elektrotların tipi ve hangi elektroporasyona dayalı tedavinin gerçekleştirildiğine, yani genlik, süre ve elektrik vuruşlarının sayısına bağlı olarak yeterli elektriksel parametrelerle konfigürasyonu. İkincisi, tümörü yeterli bir elektrik alanı ile örtmek için elektrotların doğru kullanımı.^[6,7,8,9] Üçüncüsü, tedavi yerinde ilacın yeterli konsantrasyonu (IRE hariç).^[10] Dördüncüsü, konakçının immünolojik tepkisi. Kanser için tüm elektroporasyona dayalı tedavilerde, bağışıklık sistemi yanıtta çok önemli bir rol oynar. Bu teknoloji, son derece etkili immünoterapinin daha uygun bir şekilde geliştirilmesinin anahtarı olabilir.^[11,12]
Burada, söz konusu elektroporasyona dayalı tedavilerin her birinin immünojenik bir strateji geliştirmek için iyi bir aday olmasının nedenlerini, elektroporasyona dayalı tedavilerin en son durumunu ve Latin Amerika’da uygulamaları için elektroporasyon cihazlarının kullanılabilirliğini inceleyeceğiz.

2. Geri Dönüşümsüz Elektroporasyon
IRE, hücre membranındaki geri dönüşümsüz yapısal değişiklikler nedeniyle hücre ölümüne neden olur ve hücre homeostazının kaybına neden olur.^[13] IRE bazlı terapötik yaklaşımlar, en az 80-100 yüksek genlikli vuruşların (1000 ila 3000 V/cm, doku elektrik direncine bağlı olarak 40 A’ya kadar akımlarla) uygulanmasıyla üretilen lokal bir ablatif tedaviden oluşur. Bu yöntem, insan ve veterinerlik tıbbında termal olmayan bir tümör ablasyonu formu olarak geniş bir uygulama bulmuştur;^{[14,15,16,17,18]} buna karın içi maligniteler,^[19,20] ve endovasküler kardiyak ablasyon dahildir.^[21]
IRE kanser hücreleri için seçici olmasa da, immünojenik hücre ölümüne neden olur, dendritik hücreleri aktive eder ve tümör kısıtlayıcı kollajeni etkilemeden stroma kaynaklı immünosupresyonu hafifletir.^[22] İmmün yetmezlik tetiklenmiş farelerde yapılan IRE tedavileri önemli ölçüde daha kötü bir yanıt gösterdi. Tümör hücrelerinin enjeksiyonu ile yeniden meydan okuma, immünokompetan olanlarda değil, fakat bu farelerde yeni tümörleri tetikledi.^[11]

3. Geri Dönüşümlü Elektroporasyon
Geri dönüşümlü elektroporasyonun temel amacı, canlılıklarını korurken hücrelere nüfuz etmektir. Aşağıdaki iki tersinir elektroporasyon tekniği, ECT ve GET halihazırda geliştirilmiş ve insan ve veterinerlik tıbbı uygulamaları haline getirilmiştir.

3.1. Elektrokemoterapi
ECT, replike eden hücreleri seçici olarak öldüren yerel bir kanser tedavisidir. Tipik bir ECT seansında hasta gelir ve seçilen anestezik prosedür gerçekleştirilir (tek bir tümörün tedavisi için lokal veya çoklu veya geniş tümörler için genel). İntravenöz Bleomisin (BLM) uygulanır ve 8 dakika sonra, ilaç dokulardaki tepe konsantrasyonuna ulaştığında, elektrik vuruşları verilir. Bu amaçla, tüm tümör yüzeyini ve bir güvenlik marjını dikkatlice kaplayan özel bir elektrot kullanılır.^[23] Seçiciliği sayesinde, sağkalımından ödün vermeden nüks riskini azaltmak için geniş sağlıklı doku marjları tedavi edilebilir. Toplam tedavi süresi yaklaşık 25 dakikadır ve birçok durumda mükemmel bir yanıt elde etmek için sadece bir seansa ihtiyaç duyulmaktadır. Tedaviden sonra hasta eve döner ve sonraki aylarda tümörün küçülmesini bekler.
ECT kullanılan elektrik vuruşları iyi kurulmuş, bunlar yaklaşık 1000 V/cm’lik bir genlik ve 1 ila 5000 Hz arasında değişebilen bir vuruş tekrarlama frekansı ile 100 µs’lik 8 monopolar kare dalga vuruşundan oluşmaktadır.^[24,25] BLM tercih edilen ilaçtır, ancak sisplatin (CDDP) de kullanılabilir. BLM›in etkinliği 1000 kattan fazla artarken, CDDP durumunda 3-4 kat artar ve tedavi edilen tümörlerin mükemmel lokal kontrolünü sağlar.^[7,25,26,27] BLM›nin hücre içi konsantrasyonu, etki mekanizmasını belirler. Sadece birkaç molekülün içselleştirilmesi, hücrelerde G2-M’in durmasına neden olur (yavaş mitotik hücre ölümü). Bu nedenle, yüksek hücre döngüsüne sahip tümör dokuları, normal hücrelere göre çok daha hassastır. Buna karşılık, milyonlarca BLM molekülü hücrelere girdiğinde, endonükleazlar gibi davranırlar ve apoptozu indüklerler.^[28] Ayrıca, BLM DNA hasarına neden olan reaktif oksijen türleri üretir.^[29] Bununla birlikte, CDDP’NİN etki mekanizması, DNA içinde onarım mekanizmalarını engelleyen ve apoptoza yol açan intra/inter-strand çapraz bağların oluşumundan oluşur.^[30]
Genel olarak, üç biyolojik mekanizma ECT›nin antitümöral etkisini belirler. İlk olarak, tümör hücrelerine verilen kemoterapi konsantrasyonunun arttırılmasıyla doğrudan sitotoksisite elde edilir.^[9,30] İkincisi, iki anti-vasküler etki: tümörün içinde kemoterapiyi yakalayan geçici vazokonstriksiyon ve mikrovasküler endotelin bariyer fonksiyonunu tehlikeye atan endotel hücre iskeletini etkileyen daha uzun ömürlü bir etki. Bu gecikmiş etki, tümör açlığına neden olur ve böylece kanser hücresi ölümüne katkıda bulunur.^[31,32] Üçüncüsü, kanser bağışıklığının yoğun bir şekilde uyarılmasını tetikleyen hasarla ilişkili sinyallerin salınmasından kaynaklanan bağışıklık sisteminin uyarılmasıdır.^[33]
ECT tedavileri, farklı efektör yollarının aracılık ettiği lokal bir bağışıklık tepkisini indükler. Kısaca, ECT›den sonra, tümörde inflamatuar infiltratlar görülür, bunun sonucunda dendritik hücre olgunlaşması ve drenaj lenf düğümüne göç eder. Monositlerin ve T lenfositlerinin aktivasyonu tarif edilmiştir, ancak uzak tedavi edilmemiş lezyonlarda, yani abscopal etkide bir yanıtı indüklemek için yeterli olmayabilir. Bağışıklık sisteminin ECT tarafından indüklenen uyarılması, (i) hücre zarındaki kalretikülinin (hücrelere saldırmak için makrofajlara işaret eden bir protein) maruz kalmasıyla aracılık eder), (ii) adenosin trifosfatın serbest bırakılması (antitümör bağışıklık tepkisinin arttırılması) ve (iii) yüksek hareketlilik grubu box 1 proteininin serbest bırakılması (gelişmiş glikozilasyon son ürünlerinin reseptörüne, inflamasyonu teşvik eden bir multiligand reseptörüne bağlanır). Bunların hepsi immünojenik hücre ölümünün ayırt edici özellikleridir.^[34] ECT, IRE gibi, tedavi sonuçlarını iyileştiren yerel bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır. İmmün yetmezliği olan fareler, immünokompetan farelere kıyasla ECT’ye daha az yanıt verir.^[35] BLM›nin kendisi, endoplazmik retikulum stres tepkisi ve reaktif oksijen türlerinin üretimi yoluyla immünojenik hücre ölümüne neden olabilir ve bu da endoplazmik retikulum proteinlerinin membran translokasyonuna neden olur. Bu proteinler arasında, bazı tümörlerde immünojenik apoptozu indükleyen calreticulin ve ERp57 bulunur. BLM, “kanser immünoeditasyonu” nedeniyle tümör mikroçevresi tarafından bastırılan CD8+ T hücrelerinin aracılık ettiği antitümör bağışıklığı yeniden aktive eder.^[36] Ek olarak, BLM›nin terapötik etkinliği, bağışıklık sisteminin bu ilacın etkinliği üzerindeki rolünü gösteren, her ikisi de immünosupresif olan TGFß veya Treglerin ablasyonu ile büyük ölçüde iyileştirilir.^[37].Yukarıda belirtilen çalışmalara dayanarak, BLM mümkün olduğunda ECT için tavsiye edilir.
Abskopal etki EKT’de nadir görülen bir olaydır. Ancak Şekil 1de gösterilen durumda görüldüğü gibi gerçekleşebilir. Bazen, ECT›den sonra, bağışıklık tepkisi, Şekil 2’de sunulan durumda görüldüğü gibi, hastalığı uzun süre stabilize etmeyi başarır. İşlemden sonra, Şekil 3’te görülebileceği gibi, tümörün şişmesi genellikle görülür. Bu ilk büyüme, nihai cevaba yol açan enflamatuar bir reaksiyon olduğu için nüks ile karıştırılmamalıdır.

Şekil 3. Bu vakada, göz kapağında sarkoid olan bir at. (a)’da ECT’nin yapıldığı gün. (b)’de, ECT›den otuz gün sonra, tümör şişme nedeniyle boyutunda bir artış yaşar. (c)’de, tek bir ECT seansından sonra tam bir yanıt elde edildi. Hayvan 400 gün boyunca ve bu çalışmanın yazıldığı tarihe kadar hastalıksız kaldı (veriler yayınlanmadı).

3.2. Gen Elektrotransfer

GET, gen transfeksiyonu için bir dağıtım sistemidir. Plazmid DNA’nın hedef dokuya enjekte edilmesinden ve ardından elektrik vuruşlarının verilmesinden oluşur.^[48] ECT aksine, almak için darbe parametreleri, daha sonra görüleceği gibi, olasılıklar geniş bir yelpazede kapsar. En çok kabul edilen protokollerden biri, kısa ve yoğun, ardından uzun ve hafif darbelerin bir kombinasyonunu kullanır. Birincisi hücre zarının geçici bir permeabilizasyonunu üretirken, ikincisi DNA’nın elektroporated hücrelere doğru elektroforetik hareketini indükler.^[49,50,51] Gen terapisi yaklaşımları arasında GET, en etkili viral olmayan tekniklerden biridir. Farklı dokuya özgü protokollerin oluşturulduğu çeşitli hayvan modellerinde (fareler, sıçanlar, tavşanlar ve evcil hayvanlar) etkinliğini kanıtlamıştır.^[52,53] Kusurlu genlere sahip hücrelerde, GET normal fonksiyonları geri getirmek için kullanılabilir. Kanser hücrelerinde, immünojenik proteinlerin üretimini indüklemek için kullanılabilir. Viral tabanlı gen terapisi yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında, GET, büyük transgenlerin hedef hücrelere aktarılabildiği, gen ekspresyonunun geçici olduğu ve insersiyonel mutasyon riski düşük olduğu için çekici özelliklere sahiptir.^[54] Bu özellikler, farklı sitokinleri kodlayan genlerin uygulanmasına dayanan aşılama amaçları veya immünostimülatör stratejiler için faydalıdır.^[33]
GET bazlı DNA aşılama protokolleri genellikle cilde veya kaslara uygulanır. Bu lokasyonlarda, esas olarak bağışıklık tepkisinin aktivasyonunda yer alan dendritik hücreler gibi antijen sunan hücreler bulunur.^[55] Buna karşılık, GET to cancer hücrelerinin uygulanması geçici bir ekspresyona neden olur, çünkü bu hücreler hızla bölünür ve hücre bölünmeleri boyunca seyreltilerek plazmidi kaybeder. Bununla birlikte, tümör hücresi transfeksiyonunun bu özelliği, antikanser sitokinler gibi immünostimülatör moleküllerin kısa süreli üretimi için özellikle yararlıdır,^[56] buradaki fikir, belirli bir antijen taşıyan kanser hücrelerine saldırmak ve yok etmek için güçlü hücre aracılı bağışıklığı indüklemektir.^[33,57,58] Çoğu antikanser immünoterapinin ortak amacı, Th1 sitokinlerinin salgılanması ile ilişkili CD8+ T hücrelerinin aracılık ettiği bir sitolitik yanıt üretmektir. Bununla birlikte, ideal etki, adaptif bağışıklık sisteminin tüm efektör bileşenlerinin, yani CD8+ T hücrelerinin, CD4+ T hücrelerinin ve antikorların koordineli aktivasyonundan oluşacaktır.^[59,60,61] Bu amaç için güçlü adaylar arasında interlökin-12 (IL-12), çünkü CD4 + T hücrelerinin Th1 hücrelerine farklılaşmasını arttırır, CD8+ T hücrelerinin, NK hücrelerinin ve NKT hücrelerinin sitotoksik işlevlerini uyarır, IFNγ sekresyonunu arttırır ve anti-anjiyojenik özellikler gösterir.^[62]
IL-12 plazmid kodlamasını kullanarak birkaç preklinik çalışmada test edilmiş ve birçok tümör modelinde etkinliğini ve güvenliğini göstermiştir.^[63,64] Bu modellerde elde edilen cesaret verici sonuçlar iki önemli klinik çalışmaya yol açmıştır. 2008 yılında ilki, metastatik melanomlu insan hastaları üzerinde yapılan bir faz I çalışmasıydı; hastaların %10’unun uzak tedavi edilmemiş lezyonlara tam bir yanıtı vardı ve %42’si hastalık stabilizasyonu veya kısmi yanıt gösterdi ^[65]. 2020’de, aynı plazmidin kullanıldığı insan hastalar üzerinde yapılan faz II çalışmasının sonuçları yayınlandı; hastaların %46’sı bir dereceye kadar sistemik yanıt gösterdi ve tedavi edilen hastaların %75’i 6 yıllık bir takip süresinden sonra hayatta kaldı.^[66]. Bu sonuçlar sadece IL-12’den değil, aynı zamanda GET prosedürünün kendisinden de kaynaklanmaktadır, çünkü sadece DNA enjeksiyonuna kıyasla DNA aşılarının immünojenitesini arttırmaktadır.^[67] GET, bahsetmeye değer tüm elektroporasyona dayalı tedavilerin ürettiği immünostimülatör etkileri paylaşır: (i) kas içine nabız verildikten sonra görülebilen lökosit infiltratları, (ii) antijen sunumu ve dendritik hücre alımı, (iii) orta düzeyli T CD4+ ve az T CD8 + lenfosit alımı ve (iv) lokal IL-1β ve TNF-α salınımında önemli bir artış.^[68]
Bununla birlikte, GET›in iyileştirilmesi sadece doğru plazmidi seçmek değildir. Doku hasarını en aza indirmek ve gen transfeksiyon verimliliğini artırmak için GET protokollerini optimize etmek için in vitro ve in vivo çalışmalar yoluyla birçok çaba sarf edilmektedir.^{[69,70,71,72]} Ek olarak, DNA alımını ve ekspresyonunu arttırmak için başarılı bir strateji, hücre dışı matrisin bir bileşeni olan hiyalüronik asidi parçalayabilen bir enzim olan hiyalüronidazın kullanılmasıdır. Bu, plazmidin hücre zarına daha yakın olmasını sağlar. Bu şekilde, DNA vuruştan sonra içselleştirilmesi için daha uygundur.^[25,73,74]
Şu anda, dört binden fazla gen terapisi ile ilgili insan klinik çalışması arasında, 30’dan fazla, bulaşıcı hastalıklar veya kanser için immünoterapi ile ilgili GET stratejilerine dayanmaktadır (www.clinicaltrials.gov).
En çok kullanılan elektroporasyon bazlı tedavilerin temel özellikleri Tablo 1’de gösterilmiştir.

4. ECT ve GET İmmünomodülatör Etkileri: Umut Verici Bir Kombinasyon Stratejisi
Daha önce tartışıldığı gibi, tüm elektroporasyona dayalı tedaviler yerel bir bağışıklık tepkisine neden olur ve bu da onları birleştirmek için ideal adaylar haline getirir. Özellikle, ECT, sistemik bir yanıt elde etmek için herhangi bir immünoterapi şekli ile birleştirilecek mükemmel bir lokal terapidir.
Veterinerlik tıbbında, ilk girişimler , diğerlerinin yanı sıra TNF-α,^[75] IL-2 ,^[76] ve IL-12^[77] gibi ECT›den sonra immünostimülatör moleküllerin enjekte edilmesinden oluşuyordu. Bazı umut verici sonuçlar elde edildi, ancak dozlama ve toksisitenin yönetilmesi zordu. Bağışıklık sisteminin yetersiz uyarılmasının paradoksal olarak tümör büyümesini artırabileceği ve onu engelleyemeyeceği gösterilmiştir.^[78,79,80] Bu nedenle, yanlış bir doz umut verici bir araştırma hattını atabilir ve bu nedenle bunu önlemek için çok dikkatli olunmalıdır.
İkinci bir seçenek olarak, ECT›nin ipilimumab, pembrolizumab veya nivolumab gibi kontrol noktası inhibitörleri ile kombinasyonu, insan hastalarında sistemik yanıtlarla bağlantılı umut verici sonuçlar göstermiştir.^[81,82,83] Bununla birlikte, düşük ve orta gelirli ülkelerde pahalı immünoterapiler veteriner hekimliği için bir seçenek değildir.
Bu bağlamda, GET, çeşitli nedenlerle ECT ile kombine edilecek immünoterapi için doğal bir seçim olarak ortaya çıkmaktadır. İlk olarak, ECT için kullanılan aynı cihaz GET için kullanılabilir. İkinci olarak, ECT kullanıcıları zaten bilgi birikimine sahiptir. Üçüncüsü, plazmid üretimi en yeni immünoterapilerin maliyetinin bir kısmı ile yapılabilir. Son olarak, hedef bölgede immünomodülatör moleküllerin daha kararlı ve sürekli kullanılabilirliğini sağlayabilir. Bu nedenlerden dolayı, ECT ve GET kombinasyonu, spontan tümörleri olan hayvan hastalarda mükemmel sonuçlar elde edebilir. Tablo 2’de, spontan tümörlü veterinerlik hastalarında kullanılan protokollerin bir özeti sunulmuştur.

Tablo 2. Gen elektrotransfer (GET) tek başına veya Elektrokimoterapi (ECT) ile kombinasyon halinde veya köpek hastalarında spontan tümörleri tedavi etmek için diğer stratejiler kullanılarak yayınlanan araştırma makalelerinin özeti. Kullanılan genlerin rapor edilen türleri parantez içinde yer almaktadır.

GET›de, DNA’nın hücrelere girmesine izin veren membrana nüfuz edebildikleri için geniş bir parametre seti iyi çalışıyor gibi görünmektedir. Bununla birlikte, piyasadaki her elektroporatör, her protokolde kullanılan darbeleri sağlayamaz; kullanılan cihazın işleyebileceği protokolü seçmek için özel dikkat gösterilmelidir. Mevcut cihazlar ve işlevleri daha sonra açıklanacaktır.
Bu çalışmanın yazıldığı tarihe kadar, GET esas olarak diğer tedavilerin etkinliğini arttırmak için kullanılmıştır. Tedavi edilen hastaların çoğu, standart tedavilerin etkisiz olduğu bilinen hastalığın çok ileri aşamalarındaydı. Bu olumsuz koşullarda bile, bağışıklık sisteminin GET ile uyarılması, tedavi sonucunun iyileştirilmesini sağlamıştır. Ayrıca, iki yazar GET kullanarak sistemik bir etki bildirmiştir: bir makale^[85] ve bir kongre sunumu.^[90] Tedavi protokollerine dahil olmanın ek faydaları, metastaz insidansının azaltılması, daha iyi lokal reaksiyonlar ve daha uzun sağkalım süreleridir.^{[85,88,92,95]}
Bleomisin ile EKT yaparken, plazmid EKT›den farklı bir zamanda veya yerde uygulanmalıdır. Bleomisinin endonükleaz aktivitesi plazmidi yok edebilir. Buna ek olarak, transfeksiyon, ilk bölünmeden sonra ölecek bir hücrede üretilirse, transgen’in daha az bir ifadesi elde edilecektir.
Bununla birlikte, GET ve ECT kombinasyonuna atfedilen faydaların çoğu sadece ECT için bildirilmiştir.^{[24,34,97,98]} GET ve ECT birleştirildiğinde, her tedavinin lokal cevaba katkısının diseksiyonu, her ikisi de oldukça etkili olduğu için çok sayıda hasta ile karşılaştırmalı bir çalışma gerektirecektir.
Birkaç hayvan modelinde, tek başına GET kullanarak sistemik bir yanıt elde etme kabiliyeti gösterilmiştir.^[99,100,101] Umut verici sonuçların bildirildiği insan hastalarda da benzer sonuçlar elde edildi,^[65,66] ve birçok klinik araştırma bu yönde ilerlemektedir.
Bu konuda araştırmanın erken bir aşamasındayız; spontan tümörleri olan köpeklerde sadece IL-12 (insan, kedi veya köpek) kullanan tedaviler test edilmiştir ve bu çalışmalar esas olarak güvenlik ve yerel yanıt üzerine odaklanmıştır. Bu konu, bir adımın atılması için yeterince olgunlaşmış bulunuyor. Spontan tümörleri olan veteriner hastalarda ECT ile beraber GET tedavilerinin sistemik etkisini araştırmak için gelecekteki çalışmalar tasarlanmalıdır.

5. Latin Amerika’da Elektroporasyona Dayalı Tedavilerin Modernliği
Latin Amerika’da, son on yılda, hem temel yönlerini açıklığa kavuşturmak hem de uygulamalarını genişletmek için elektroporasyona dayalı tedavilerle ilgili çeşitli araştırma projeleri başladı. Özellikle, Dr. Marshall grubu bu konuda çeşitli yayınlar yaptı.^{[10,70,97,102,103,104,105,106,107,108]} Veteriner hekimlikte ECT kullanımı 2008 yılında Brezilya’da Dr. Rangel Grubu tarafından başladı,^{[109,110,111,112,113,114]} bunu 2009’da Arjantin’den Dr. Marshall grubu takip etti. Bu tedavi 2006 yılından bu yana Avrupa’da insan tıbbında kullanılmasına rağmen, Latin Amerika’da ne insan tıbbı ne de veteriner tıbbı için herhangi bir cihaz mevcut değildi. Bu elektroporatörlerin eksikliği ve aynı zamanda bilgi eksikliği bu teknolojinin uygulanmasını engelledi. ECM 830 (BTX-Harvard aparatı, Holliston, MA, ABD), Latin Amerika’da veteriner hekimlikte kullanılan ilk laboratuvar cihazıydı ve klinik prosedürler için bir laboratuvar cihazı kullanmanın tüm dezavantajları vardı. Elektrotlar, literatür ve uzmanların tavsiyelerini ve tavsiyelerini takip ederek her grup tarafından geliştirilmelidir.
Daha fazla deneyim toplandıkça, 2013 yılında, Latin Amerika’daki veterinerler için ilk ECT kursu, Dr. Rangel tarafından yönetilen Portekizce olarak sunuldu. Portekizce sadece Brezilya’da konuşulurken, diğer Tüm Latin Amerika ülkeleri İspanyolca konuşulmaktadır. 2018 yılına kadar, Dr. Marshall, Dr. Maglietti ve Dr. Tellado tarafından yönetilen İspanyolca bir eğitim kursunun mevcudiyeti ile tekniğin daha birçok ülkeye yayıldığı görülmedi. Elektroporasyona dayalı tedavilerle ilgili bilgilerin çoğu İngilizce’dir ve bu nedenle Latin Amerika’daki veterinerlerin çoğu için erişilebilir değildir. Sonuç olarak, ispanyolca’da güncellenmiş bilgilerin kullanılabilirliği çok bekleniyordu (https://vetoncologia.com/cursos/curso-electroquimioterapia-veterinaria-online/). 2019 yılında, Uluslararası Elektroporasyona Dayalı Teknolojiler ve Tedaviler Derneği (ISEBTT), Avrupa ve Amerika Birleşik Devletleri dışında aktarılan bilgileri doğrulayarak bu kursa destek verdi. 2020’de Elektroporasyona dayalı teknolojiler ve tedaviler kitabının ilk baskısı Dr. Maglietti tarafından İspanyolca’ya çevrildi. 2003 yılından bu yana Ljubljana, Slovenya’da düzenlenen Elektroporasyon tabanlı teknolojiler ve tedaviler Okulunun temel ders materyalini içerir ((www.ebtt.org) ve ücretsiz çevrimiçi olarak kullanılabilir (book.ebtt.org).
ECT kullanımı inanılmaz bir hızla büyüdü ve 2019 yılı sonuna kadar 150’den fazla merkezde 20.000’den fazla hasta tedavi edildi. Latin Amerika’daki yirmi ülkeden onunda ECT var: Arjantin, Brezilya, Şili, Kolombiya, Ekvador, Guatemala, Meksika, Paraguay, Peru ve Uruguay (bkz. Şekil 4). EPV-100 Cihazının (BİOTEX SRL, Buenos Aires, Arjantin) geliştirilmesi, İspanyolca’da uzatılmış bir garanti ve tam müşteri desteği sağladı ve bu da veteriner hekimleri kliniklerinde ECT yapmaya teşvik etti. Teknolojinin bu kadar hızlı genişlemesinin bir başka nedeni, veterinerlik tıbbındaki diğer onkolojik tedavilere kıyasla çok düşük maliyetidir. Örneğin, son derece etkili bir prosedür olan radyoterapi, Latin Amerika’daki çok az merkezde mevcuttur ve maliyeti çoğu evcil hayvan sahibi için engelleyici hale getirir.

Şekil 4. Latin Amerika haritası. Turuncu noktalar, ECT’nin veterinerlik tıbbında standart bir bakım olarak uygulandığı ülkeleri gösterir.

GET ile ilgili olarak, sadece iki grup, Dr. Signori (İtalya) ile iş birliği içinde Arjantin’deki Dr. Marshall grubu ve Prof. Cemazar (Slovenya) ile işbirliği içinde Brezilya’daki Dr. Rangel grubu olan evcil hayvanlar üzerinde denemelerini başlattı. Bu denemeler halen devam etmekte olup, daha önce bahsedilen umut verici sonuçları olan bir kongre sunumu yayınlanmıştır.^[90]
Toplanan deneyim ve bilgi miktarı, veteriner hekimlerin ve araştırmacıların çalışmalarının sonuçlarını sundukları yıllık uluslararası toplantıların organizasyonunu mümkün kıldı. İlk toplantı Buenos Aires, Arjantin’de, 2018’de, ikincisi Sao Paulo, Brezilya’da, 2019’da yapıldı ve gelecek toplantılar da devam edecektir. Avrupa ve ABD’den uzmanlar bu toplantılara katıldı ve elektroporasyona dayalı tedavileri paylaşmak ve tartışmak için mükemmel bir fırsat sağladı.

6. Latin Amerika’da Veterinerlik Tıbbı İçin Kullanılabilen Elektroporatörler

Mükemmel elektroporator diye bir şey yoktur ve ideal cihaz henüz inşa edilmemiştir. Her cihazın, elektroporasyona dayalı tedavinin mümkün olan en iyi sonucunu elde etmek için veteriner hekimlerin bilmesi gereken avantajları ve dezavantajları vardır. Çoğu cihaz, elektrik parametrelerinin iyi tanımlandığı ECT uygulamaları için optimize edilmiştir. GET uygulamalarında, birçok seçenek mevcut olduğundan durum daha karmaşıktır.
Latin Amerika’da farklı elektroporatörlerin uygun bir fiyata bulunması, ECT’nin genişlemesini mümkün kıldı. Deneyimli kullanıcılar manuel cihazları kullanmayı tercih edebilir, çünkü bu, her bir gelişme için vuruş parametreleri ayarlanabileceğinden yeni elektrotların tasarlanmasına izin verir. Bununla birlikte, en iyi sonuçları elde etmek için Elektrokemoterapi için standart çalışma prosedürlerinde belirlenen nabız parametrelerine uymak çok önemlidir.^[25] Örneğin, iğneleri birbirinden 4 mm ayrılmış özel olarak üretilmiş bir elektrotta 1000 V / cm sağlamak, cihazın 400 V verecek şekilde ayarlanmasını gerektirecektir; başka bir durumda, 8 mm’lik bir aralıkla, cihaz, 800 V vuruş sayısı verecek şekilde ayarlanmalıdır ve süre, araştırma amaçlı olmadıkça değiştirilmemelidir (100 µs’lik 8 vuruş). Frekansın 1 ila 5000 Hz arasında değişen tedavi sonucuna etkisi yoktur. 100 Hz’nin üzerinde sadece bir kas kasılması görülür ve 5000 Hz’ye yakın kas kasılması daha az yoğundur.^[115] Veterinerlik ortamında düzenli kullanım için otomatik bir cihaz en iyi seçimdir. Kendi kendine yapılandırılmış cihazlar daha güvenlidir ve darbe konfigürasyonundaki hataları önledikleri için daha iyi tedavi sonuçları sağlar.
Bazı cihazlar klasik monopolar yerine bipolar vuruşlar verir. Monopolar veya bipolar vuruş kullanımının ECT etkinliği üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Bununla birlikte, bipolar olanlar, pozitif ve negatif sapma arasındaki duraklama minimum (simetrik bipolar darbeler) olduğu sürece, GET için bazı avantajlar gösterebilir, aksi takdirde bu avantaj kaybolur.^[116]
Cihaz, vuruş prosedürü sırasında voltajı sürdürmelidir, ancak ne yazık ki, bunu kontrol etmek bir osiloskop gerektirir. Bir elektroporatörün maksimum akım çıkışı, voltaj düşüşlerini önleme kabiliyetine bağlıdır. Uzun iğneli bazı elektrotlar ve daha düşük elektrik direncine sahip tümörler, uygun tedavi için yüksek bir elektrik akımı çıkışı gerektirecektir.
Her üretici cihazlarını Latin Amerika’ya göndermeye istekli değildir. Tablo 3’te, Latin Amerika’da bulunabilen elektroporatörlerin bir listesi sunulmaktadır. Belirtilen tüm cihazlar ECT yapabilir. Bununla birlikte, GET›i gerçekleştirmek için cihazımızın gerçekleştirebileceği bir protokol seçmeliyiz. Yüksek voltajlı ve ardından düşük voltajlı vuruşlar (HV+LV) protokolleri sadece Clinivet (IGEA, Carpı, İtalya) veya BTX ECM 830 (Harvard aparatı, Holliston, MA, ABD) elektroporatörleri ile uygulanabilir. Bazı cihazlar, cihazların kendi kendine yapılandırıldığı EPV-100 (BIOTEX, Arjantin), Oncopore (BIOTEX, Arjantin) ve Clinivet (IGEA, Carpi, İtalya) gibi GET için özel modlara sahiptir. Diğer durumlarda, ECT›ye daha benzer protokoller kullanılabilir.

Tablo 3. Latin Amerika’da ticari olarak temin edilebilen elektroporatörler.

Cliniporator (IGEA, Carpi, İtalya), insan kullanımı için onaylanmış ilk elektroporatördür. Bununla birlikte, insan kullanımı için onaylanmış tek bir cihazın, Oncopore’un (BIOTEX, Arjantin) olduğu Latin Amerika’da mevcut değildir.
Elektrotlar, her cihazın önemli bir parçasıdır. Üretici tarafından sağlanan elektrotlar kullanıldığı sürece, optimum tedavi için yeterli bir elektrik alanı sağlamak üzere tasarlanmıştır. Farklı modeller, vücudun farklı bölümlerinin daha fazla veya daha az zorlukla tedavi edilmesine izin verir. Tipik elektrotlar, tedavi uzmanının bilmesi gereken doğru kullanımları için özel endikasyonlara sahip iğnelere veya plakalara sahiptir. Yeniden kullanılabilir elektrotlar sadece veteriner hekimliği için kullanılabilir, çünkü insan tıbbı sadece tek kullanımlık olanları kullanır. Paslanmayacakları için tedavinin etkinliğine bir artı eklerler (pas, tek bir kullanımdan sonra bile iğnenin parçalarını izole edebilir) ve her tedavi için en iyi keskinliğe sahiptirler. Şekil 5’te farklı elektrotların bir örneği görülebilir.

Şekil 5. Veteriner hekimlikte ECT için farklı elektrotlar. (a)’da altı iğneli bir elektrot. (b)’de, ince iğneler kullanan dört iğneli bir elektrot. (c)’de, ince iğneli elektrot için 90 derecelik bir sap. (d)’de, burun kanalını tedavi etmek için bir elektrot. (e)’de, üstte, tek kullanımlık iğneler, altta, saplara takılabilen plaka elektrotu. BIOTEX SRL’nin izniyle.

7. Son Hususlar ve Sonuçlar
İnsan ve veterinerlik elektroporasyonuna dayalı tedaviler, temel yönlerinde birçok benzerliği paylaşmaktadır. Bununla birlikte, pratikte, veteriner tedavilerinin bazı özellikleri vardır.
Veteriner hastalar genellikle hastalığın ileri evrelerinde ilk ziyarete gelirler, esas olarak erken tanı koyabilen veterinerler arasında onkologların olmaması nedeniyle, son yıllarda tersine dönen bir eğilim. Bu durum, daha büyük tümörlerde daha tatmin edici olmayan bir yanıt elde etme eğiliminde olduğu için, elektroporasyona dayalı herhangi bir tedavinin, özellikle de ECT başarısını azaltır.^[98]
Sahipleri daha önce danışmaya teşvik etmek, uygulanan herhangi bir tedavinin sonuçlarını iyileştirecektir. Veteriner hekimler hastalarını sorgulayamazlar ve sahiplerinin cevaplarına güvenmek ve onları desteklemek zorundadırlar. Evcil hayvanlar kanser nedeniyle ya da ciddi şekilde şekilsiz oldukları için depresyonda hissetmezler, ancak sahipleri bunu hissettiklerinde çok etkilenirler.
En sık tedavi edilen türler köpek, kedi ve atlardır. Aynı türlerde bile, aşağıdaki gibi bazı hususlar gerektiren çok çeşitli boyutlar ve ağırlıklar mevcuttur.
ECT ile ilgili olarak, intravenöz BLM kullanarak kediler ve Köpekler gibi küçük hayvanları tedavi ederken, ilacın dağıtımı için daha az zaman gerekir (tipik 8 dakika yerine 5 dakika). Kediler için CDDP kullanımı önerilmez. Atlarda, ilacın lokal olarak uygulanması sıklıkla kullanılır, çünkü intravenöz ilaç tedavisi, tedaviyi son derece pahalı hale getirecek büyük miktarda ilaç gerektirir. Çoğu zaman, optimum tedavi için özel olarak tasarlanmış elektrotlar gereklidir.
GET ile ilgili olarak, bazı genlerin türler arasında sergilediği yüksek benzerliğe rağmen, türe özgü genleri kullanmak her zaman daha iyidir. Bu, terapötik proteini nötralize eden antikorların oluşumunu önleyecektir. Dahası, belirli bir doku hacmine nüfuz eden standart bir elektrot kullanmak, farklı hayvanlar arasında çok farklı olabilir. Örneğin, bir atın aksine bir kaniş içinde 8 × 8 × 10 mm’lik bir hacme nüfuz etmek aynı değildir. Bu durumda, üretilen terapötik protein miktarı aynı olabilir, ancak kg başına doz ve daha sonra etki farklı olacaktır.
Egzotik hayvanlar, standart kurallar geçerli olmayabileceğinden, başarılı bir tedaviyi gerçekleştirmek için özel bakım ve bilgiye ihtiyaç duyulan tamamen yeni bir bölümdür.^{[117,118,119,120]} Benzer bir durum, bu tedavilerin boğalar gibi üreme değeri olan hayvanlar için çok yararlı olabileceği hayvan hayvanlarında da görülür. Bununla birlikte, bu hayvanlarda kemoterapi veya gen terapisinin kullanımı ile ilgili özel düzenlemeler uygulanır ve ülkeye göre değişir.
Veteriner teşhis prosedürleri durumu, maddi imkanları sınırlı, kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, insan tıbbından farklı olarak immünohistokimya, bilgisayarlı tomografi taramaları ve manyetik rezonans görüntüleri yapmak her zaman mümkün değildir.
Bağışıklık sistemi ile kanser etkileşimi hakkındaki mevcut ilerlemelerle, artık kanser hücrelerinin konakçının bağışıklık tepkisinden kaçabileceğini, regülasyonu azaltabileceğini veya hatta fayda sağlayabileceğini biliyoruz.^{[79,121,122,123]} Bağışıklık sisteminin kansere karşı koruyucu işlevini yerine getirmek için büyük çaba sarf ediliyor ve pembrolizumab ve ipilimumab gibi yeni immünomodülatör ilaçlar geliştirildi ve standart tedavi ile kombine edildiğinde umut verici sonuçlar gösterdi.^[124] Bu ilaçlar 1997’den beri geliştirilmiştir ve çok çeşitli antijenleri hedeflemektedir. Farklı kanser türleri için etkinliklerini göstermek için insan hastalarında çeşitli klinik çalışmalar yapılmıştır.^[125] Bununla birlikte, son derece yüksek maliyetleri, düşük ve orta gelirli ülkelerde insan onkolojisinde çok zor ve veteriner onkolojisinde imkansız hale getirmektedir. ^[126] Bu tedaviler, özellikle ortalama maaşların genellikle yaşamak için yeterli olmadığı düşük ve orta gelirli ülkelerde, toplumun zengin bir sektörü için ayrılmıştır. Evcil hayvanlara yeterli onkolojik tedavi sağlamak önemli bir ekonomik çabadır. Bu ortamda, elektroporasyona dayalı tedaviler, bu tedavilerin Latin Amerika’da sahip olduğu önemli büyümenin gösterdiği gibi, kanserli Evcil Hayvanlar için tedaviye erişimi demokratikleştirmektedir.
Ek bir avantaj, veteriner klinik ortamında çok fazla deneyim toplanmasıdır ve spontan tümörleri olan eşlik eden hayvanların Translasyonel Onkoloji için en iyi modeller olduğu iyi bilinmektedir.^{[127,128,129]} Veteriner hekimlikte ECT ve GET ile ilgili çok sayıda klinik çalışma, insan klinik çalışmalarında kullanılacak prosedürler için preklinik doğrulama olarak kullanılabilecek çok değerli bilgiler vermektedir. Bununla birlikte, GET durumunda, insan tıbbındaki sonuçlar veterinerlik tıbbından daha gelişmiş olduğundan, yol başka bir şekilde yürümelidir. Çoğu zaman, farklı hayvanlar vücutlarına araştırma konuları olarak veya hatta öğrenme veya eğitim amaçlı hizmet vermelerini sağlamıştır. Şimdi bu iyiliğe karşılık verme zamanı. İnsan tıbbı araştırmacıları artık deneyimlerini veterinerlere sunmalı, böylece eşlik eden hayvanlarda elektroporasyona dayalı tedaviler kullanarak başarılı bir immünoterapi protokolü elde etmek için protokolleri ve prosedürleri uyarlayabilirler. ECT artı GET kombinasyonu bu nedenle beklediğimiz savaş atı olabilir.

Yazar Katkıları
Kavramsallaştırma, ES, FM ve MT; yazı – orijinal taslak hazırlama, FM, MT, JF ve MDR; veri iyileştirme, FM, MT ve SM; yazma – gözden geçirme ve düzenleme, ES, SM ve GM; finansman sağlama, GM ve ES. Tüm yazarlar makalenin yayınlanmış versiyonunu okudu ve kabul etti.

Finansman
FM, SM ve GM, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas’tan (CONICET) araştırmacılardır. Bu çalışma CONICET tarafından sağlanan hibe ile desteklenmektedir, www.conicet.gov.ar, (PIP 379/2012/2016 and STAN 534/12); AGENCIA (PICT 2017-3802); CNR (CNR Project DSB.AD007.072) ve Universidad de Buenos Aires, www.uba.ar, (UBACyT 2014/2017). E. Signori kısmen CNR-Short Term Mobility Fellowship Prot N° 72648/2019 tarafından desteklendi. Finansman sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Teşekkürler
Bu makale, Uluslararası Elektroporasyona Dayalı Teknoloji ve Tedaviler Derneği tarafından oluşturulan ağ sayesinde mümkün olmuştur.

Çıkar Çatışması
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Kısaltmalar

Referanslar

1. Albert, A.; Bulcroft, K. Pets and Urban Life. Anthrozoös 1987, 1, 9–25.
2. Mir, L.M.; Orlowski, S.; Belehradek, J., Jr.; Paoletti, C. Electrochemotherapy potentiation of antitumour effect of bleomycin by local electric pulses. Eur. J. Cancer 1991, 27, 68–72.
3. Mir, L.M.; Belehradek, M.; Domenge, C.; Orlowski, S.; Poddevin, B.; Belehradek, J., Jr.; Schwaab, G.; Luboinski, B.; Paoletti, C. Electrochemotherapy, a new antitumor treatment: First clinical trial. C. R. Acad. Sci. III 1991, 313, 613–618.
4. Neumann, E.; Schaefer-Ridder, M.; Wang, Y.; Hofschneider, P.H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1982, 1, 841–845.
5. Frandsen, S.K.; Vissing, M.; Gehl, J. A Comprehensive Review of Calcium Electroporation—A Novel Cancer Treatment Modality. Cancers 2020, 12, 290.
6. Kotnik, T.; Kramar, P.; Pucihar, G.; Miklavcic, D.; Tarek, M. Cell membrane electroporation—Part 1: The phenomenon. IEEE Electr. Insul. Mag. 2012, 28, 14–23.
7. Mir, L.M. Bases and rationale of the electrochemotherapy. In Proceedings of the 11th Mediterranean Conference on Medical and Biomedical Engineering and Computing, Ljubljana, Slovenia, 26–30 June 2007; p. 622.
8. Rubinsky, B. Irreversible Electroporation; Springer: Berlin/Heidelberg, Germany, 2009; ISBN 9783642054204.
9. Miklavcic, D.; Corovic, S.; Pucihar, G.; Pavselj, N. Importance of tumour coverage by sufficiently high local electric field for effective electrochemotherapy. Eur. J. Cancer Suppl. 2006, 4, 45–51.
10. Maglietti, F.; Tellado, M.; Olaiz, N.; Michinski, S.; Marshall, G. Combined local and systemic bleomycin administration in electrochemotherapy to reduce the number of treatment sessions. Radiol. Oncol. 2016, 50, 58–63.
11. Neal, R.E.; Rossmeisl, J.H., Jr.; Robertson, J.L.; Arena, C.B.; Davis, E.M.; Singh, R.N.; Stallings, J.; Davalos, R.V. Improved local and systemic anti-tumor efficacy for irreversible electroporation in immunocompetent versus immunodeficient mice. PLoS ONE 2013, 8, e64559.
12. Mir, L.M.; Orlowski, S. Mechanisms of electrochemotherapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 1999, 35, 107–118.
13. Meijerink, M.R.; Scheffer, H.J.; Narayanan, G. Irreversible Electroporation in Clinical Practice; Springer: Berlin/Heidelberg, Germany, 2017; ISBN 9783319551135.
14. Scheltema, M.; de la Rosette, J. Irreversible Electroporation of Prostate Tumors. In Irreversible Electroporation in Clinical Practice; Springer: Cham, Switzerland, 2018; pp. 215–222.
15. Koukounaras, J.; Kavnoudias, H.; Thomson, K.R. Irreversible Electroporation of Kidney Tumours. In Irreversible Electroporation in Clinical Practice; Springer: Cham, Switzerland, 2018; pp. 201–213.
16. Kodama, H.; Srimathveeravalli, G.; Solomon, S.B. Irreversible Electroporation of Lung Tumors. In Irreversible Electroporation in Clinical Practice; Springer: Cham, Switzerland, 2018; pp. 239–245.
17. Wiggermann, P.; Brünn, K.; Bäumler, W. Irreversible electroporation (IRE): A minimally invasive therapeutic option in prostate cancer. Radiologe 2017, 57, 637–640.
18. Niessen, C.; Thumann, S.; Beyer, L.; Pregler, B.; Kramer, J.; Lang, S.; Teufel, A.; Jung, E.M.; Stroszczynski, C.; Wiggermann, P. Percutaneous Irreversible Electroporation: Long-term survival analysis of 71 patients with inoperable malignant hepatic tumors. Sci. Rep. 2017, 7, 43687.
19. Chan, G.; Pua, U. Irreversible Electroporation of the Pancreas. Semin. Intervent. Radiol. 2019, 36, 213–220.
20. Ma, Y.-Y.; Shi, J.-J.; Chen, J.-B.; Xu, K.-C.; Niu, L.-Z. Irreversible electroporation for liver metastasis from pancreatic cancer: A case report. World J. Clin. Cases 2020, 8, 390–397.
21. Van Es, R.; Konings, M.K.; Du Pré, B.C.; Neven, K.; van Wessel, H.; van Driel, V.J.H.M.; Westra, A.H.; Doevendans, P.A.F.; Wittkampf, F.H.M. High-frequency irreversible electroporation for cardiac ablation using an asymmetrical waveform. Biomed. Eng. Online 2019, 18, 75.
22. Zhao, J.; Wen, X.; Tian, L.; Li, T.; Xu, C.; Wen, X.; Melancon, M.P.; Gupta, S.; Shen, B.; Peng, W.; et al. Irreversible electroporation reverses resistance to immune checkpoint blockade in pancreatic cancer. Nat. Commun. 2019, 10, 899.
23. Mir, L.M.; Orlowski, S. The Basis of Electrochemotherapy. In Electrochemotherapy, Electrogenetherapy, and Transdermal Drug Delivery; Humana Press: Totowa, NJ, USA, 2000; pp. 99–117.
24. Cemazar, M.; Tamzali, Y.; Sersa, G.; Tozon, N.; Mir, L.M.; Miklavcic, D.; Lowe, R.; Teissie, J. Electrochemotherapy in veterinary oncology. J. Vet. Intern. Med. 2008, 22, 826–831.
25. Gehl, J.; Sersa, G.; Matthiessen, L.W.; Muir, T.; Soden, D.; Occhini, A.; Quaglino, P.; Curatolo, P.; Campana, L.G.; Kunte, C.; et al. Updated standard operating procedures for electrochemotherapy of cutaneous tumours and skin metastases. Acta Oncol. 2018, 57, 874–882.
26. Miklavčič, D.; Mali, B.; Kos, B.; Heller, R.; Serša, G. Electrochemotherapy: From the drawing board into medical practice. Biomed. Eng. Online 2014, 13, 29.
27. Spugnini, E.P.; Vincenzi, B.; Citro, G.; Dotsinsky, I.; Mudrov, T.; Baldi, A. Evaluation of Cisplatin as an electrochemotherapy agent for the treatment of incompletely excised mast cell tumors in dogs. J. Vet. Intern. Med. 2011, 25, 407–411.
28. Tounekti, O.; Pron, G.; Belehradek, J., Jr.; Mir, L.M. Bleomycin, an apoptosis-mimetic drug that induces two types of cell death depending on the number of molecules internalized. Cancer Res. 1993, 53, 5462–5469.
29. Chen, J.; Ghorai, M.K.; Kenney, G.; Stubbe, J. Mechanistic studies on bleomycin-mediated DNA damage: Multiple binding modes can result in double-stranded DNA cleavage. Nucleic Acids Res. 2008, 36, 3781–3790.
30. Cepeda, V.; Fuertes, M.A.; Castilla, J.; Alonso, C.; Quevedo, C.; Pérez, J.M. Biochemical mechanisms of cisplatin cytotoxicity. Anti-Cancer Agents Med. Chem. 2007, 7, 3–18.
31. Jarm, T.; Cemazar, M.; Miklavcic, D.; Sersa, G. Antivascular effects of electrochemotherapy: Implications in treatment of bleeding metastases. Expert Rev. Anti-Cancer Ther. 2010, 10, 729–746.
32. Sersa, G.; Jarm, T.; Kotnik, T.; Coer, A.; Podkrajsek, M.; Sentjurc, M.; Miklavcic, D.; Kadivec, M.; Kranjc, S.; Secerov, A.; et al. Vascular disrupting action of electroporation and electrochemotherapy with bleomycin in murine sarcoma. Br. J. Cancer 2008, 98, 388–398.
33. Calvet, C.Y.; Mir, L.M. The promising alliance of anti-cancer electrochemotherapy with immunotherapy. Cancer Metastasis Rev. 2016, 35, 165–177.
34. Calvet, C.Y.; Famin, D.; André, F.M.; Mir, L.M. Electrochemotherapy with bleomycin induces hallmarks of immunogenic cell death in murine colon cancer cells. Oncoimmunology 2014, 3, e28131.
35. Sersa, G.; Teissie, J.; Cemazar, M.; Signori, E.; Kamensek, U.; Marshall, G.; Miklavcic, D. Electrochemotherapy of tumors as in situ vaccination boosted by immunogene electrotransfer. Cancer Immunol. Immunother. 2015, 64, 1315–1327.
36. Dunn, G.P.; Old, L.J.; Schreiber, R.D. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity 2004, 21, 137–148.
37. Bugaut, H.; Bruchard, M.; Berger, H.; Derangère, V.; Odoul, L.; Euvrard, R.; Ladoire, S.; Chalmin, F.; Végran, F.; Rébé, C.; et al. Bleomycin exerts ambivalent antitumor immune effect by triggering both immunogenic cell death and proliferation of regulatory T cells. PLoS ONE 2013, 8, e65181.
38. National Institute for Health and Care Excellence. Electrochemotherapy for Metastases in the Skin from Tumours of Non-Skin Origin and Melanoma; NICE: London, UK, 2013.
39. Jamsek, C.; Sersa, G.; Bosnjak, M.; Groselj, A. Long term response of electrochemotherapy with reduced dose of bleomycin in elderly patients with head and neck non-melanoma skin cancer. Radiol. Oncol. 2020, 54, 79–85.
40. Spugnini, E.P.; Baldi, A. Electrochemotherapy in Veterinary Oncology: State-of-the-Art and Perspectives. Vet. Clin. N. Am. Small Anim. Pract. 2019, 49, 967–979.
41. Spugnini, E.P.; Vincenzi, B.; Amadio, B.; Baldi, A. Adjuvant electrochemotherapy with bleomycin and cisplatin combination for canine soft tissue sarcomas: A study of 30 cases. Open Vet. J. 2019, 9, 88–93.
42. Spugnini, E.P.; Pizzuto, M.; Filipponi, M.; Romani, L.; Vincenzi, B.; Menicagli, F.; Lanza, A.; De Girolamo, R.; Lomonaco, R.; Fanciulli, M.; et al. Electroporation Enhances Bleomycin Efficacy in Cats with Periocular Carcinoma and Advanced Squamous Cell Carcinoma of the Head. J. Vet. Intern. Med. 2015, 29, 1368–1375.
43. Edhemovic, I.; Brecelj, E.; Gasljevic, G.; Marolt Music, M.; Gorjup, V.; Mali, B.; Jarm, T.; Kos, B.; Pavliha, D.; Grcar Kuzmanov, B.; et al. Intraoperative electrochemotherapy of colorectal liver metastases. J. Surg. Oncol. 2014, 110, 320–327.
44. Casadei, R.; Ricci, C.; Ingaldi, C.; Alberici, L.; Di Marco, M.; Guido, A.; Minni, F.; Serra, C. Intraoperative electrochemotherapy in locally advanced pancreatic cancer: Indications, techniques and results-a single-center experience. Updates Surg. 2020.
45. Impellizeri, J.; Aurisicchio, L.; Forde, P.; Soden, D.M. Electroporation in veterinary oncology. Vet. J. 2016, 217, 18–25.
46. Cemazar, M.; Sersa, G. Recent Advances in Electrochemotherapy. Bioelectricity 2019, 1, 204–213.
47. REVEAL 2 Trial (Evaluation of VGX-3100 and Electroporation for the Treatment of Cervical HSIL)—Full Text View—ClinicalTrials.gov. Available online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03721978(4 Haziran 2020 tarihinde erişildi).
48. André, F.; Mir, L.M. DNA electrotransfer: Its principles and an updated review of its therapeutic applications. Gene Ther. 2004, 11, S33–S42.
49. Satkauskas, S.; Bureau, M.F.; Puc, M.; Mahfoudi, A.; Scherman, D.; Miklavcic, D.; Mir, L.M. Mechanisms of in vivo DNA electrotransfer: Respective contributions of cell electropermeabilization and DNA electrophoresis. Mol. Ther. 2002, 5, 133–140.
50. André, F.M.; Gehl, J.; Sersa, G.; Préat, V.; Hojman, P.; Eriksen, J.; Golzio, M.; Cemazar, M.; Pavselj, N.; Rols, M.-P.; et al. Efficiency of high- and low-voltage pulse combinations for gene electrotransfer in muscle, liver, tumor, and skin. Hum. Gene Ther. 2008, 19, 1261–1271.
51. Gothelf, A.; Gehl, J. Gene electrotransfer to skin; review of existing literature and clinical perspectives. Curr. Gene Ther. 2010, 10, 287–299.
52. Gothelf, A.; Gehl, J. Gene Electrotransfer to Skin. In Clinical Aspects of Electroporation; Springer: New York, NY, USA, 2011; pp. 189–201.
53. Andre, F.M.; Mir, L.M. Nucleic acids electrotransfer in vivo: Mechanisms and practical aspects. Curr. Gene Ther. 2010, 10, 267–280.
54. Villemejane, J.; Mir, L.M. Physical methods of nucleic acid transfer: General concepts and applications. Br. J. Pharmacol. 2009, 157, 207–219.
55. Riccardo, F.; Barutello, G.; Petito, A.; Tarone, L.; Conti, L.; Arigoni, M.; Musiu, C.; Izzo, S.; Volante, M.; Longo, D.L.; et al. Immunization against ROS1 by DNA Electroporation Impairs K-Ras-Driven Lung Adenocarcinomas. Vaccines 2020, 8, 166.
56. Combadiere, B.; Liard, C. Transcutaneous and intradermal vaccination. Hum. Vaccin. 2011, 7, 811–827.
57. Kutzler, M.A.; Weiner, D.B. DNA vaccines: Ready for prime time? Nat. Rev. Genet. 2008, 9, 776–788.
58. Remic, T.; Sersa, G.; Ursic, K.; Cemazar, M.; Kamensek, U. Development of Tumor Cell-Based Vaccine with IL-12 Gene Electrotransfer as Adjuvant. Vaccines 2020, 8, 111.
59. Vesely, M.D.; Kershaw, M.H.; Schreiber, R.D.; Smyth, M.J. Natural Innate and Adaptive Immunity to Cancer. Annual Rev. Immunol. 2011, 29, 235–271.
60. Braumüller, H.; Wieder, T.; Brenner, E.; Aßmann, S.; Hahn, M.; Alkhaled, M.; Schilbach, K.; Essmann, F.; Kneilling, M.; Griessinger, C.; et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature 2013, 494, 361–365.
61. Kranjc Brezar, S.; Mrak, V.; Bosnjak, M.; Savarin, M.; Sersa, G.; Cemazar, M. Intratumoral Gene Electrotransfer of Plasmid DNA Encoding shRNA against Melanoma Cell Adhesion Molecule Radiosensitizes Tumors by Antivascular Effects and Activation of an Immune Response. Vaccines 2020, 8, 135.
62. Colombo, M.P.; Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 2002, 13, 155–168.
63. Yamashita, Y.I.; Shimada, M.; Hasegawa, H.; Minagawa, R.; Rikimaru, T.; Hamatsu, T.; Tanaka, S.; Shirabe, K.; Miyazaki, J.I.; Sugimachi, K. Electroporation-mediated interleukin-12 gene therapy for hepatocellular carcinoma in the mice model. Cancer Res. 2001, 61, 1005–1012.
64. Lampreht Tratar, U.; Loiacono, L.; Cemazar, M.; Kamensek, U.; Fazio, V.M.; Sersa, G.; Signori, E. Gene Electrotransfer of Plasmid-Encoding IL-12 Recruits the M1 Macrophages and Antigen-Presenting Cells Inducing the Eradication of Aggressive B16F10 Murine Melanoma. Mediat. Inflamm. 2017, 2017, 5285890.
65. Daud, A.I.; DeConti, R.C.; Andrews, S.; Urbas, P.; Riker, A.I.; Sondak, V.K.; Munster, P.N.; Sullivan, D.M.; Ugen, K.E.; Messina, J.L.; et al. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5896–5903.
66. Algazi, A.; Bhatia, S.; Agarwala, S.; Molina, M.; Lewis, K.; Faries, M.; Fong, L.; Levine, L.P.; Franco, M.; Oglesby, A.; et al. Intratumoral delivery of tavokinogene telseplasmid yields systemic immune responses in metastatic melanoma patients. Ann. Oncol. 2020, 31, 532–540.
67. Lopes, A.; Vandermeulen, G.; Préat, V. Cancer DNA vaccines: Current preclinical and clinical developments and future perspectives. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2019, 38, 146.
68. Chiarella, P.; Massi, E.; De Robertis, M.; Sibilio, A.; Parrella, P.; Fazio, V.M.; Signori, E. Electroporation of skeletal muscle induces danger signal release and antigen-presenting cell recruitment independently of DNA vaccine administration. Expert Opin. Biol. Ther. 2008, 8, 1645–1657.
69. Calvet, C.Y.; Thalmensi, J.; Liard, C.; Pliquet, E.; Bestetti, T.; Huet, T.; Langlade-Demoyen, P.; Mir, L.M. Optimization of a gene electrotransfer procedure for efficient intradermal immunization with an hTERT-based DNA vaccine in mice. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2014, 1, 14045.
70. Maglietti, F.; Michinski, S.; Olaiz, N.; Castro, M.; Suárez, C.; Marshall, G. The role of pH fronts in tissue electroporation based treatments. PLoS ONE 2013, 8, e80167.
71. Peri, D.; Deville, M.; Poignard, C.; Signori, E.; Natalini, R. Numerical optimization of plasmid DNA delivery combined with hyaluronidase injection for electroporation protocol. Comput. Methods Progr. Biomed. 2020, 186, 105204.
72. Sieni, E.; Dettin, M.; De Robertis, M.; Bazzolo, B.; Conconi, M.T.; Zamuner, A.; Marino, R.; Keller, F.; Campana, L.G.; Signori, E. The Efficiency of Gene Electrotransfer in Breast-Cancer Cell Lines Cultured on a Novel Collagen-Free 3D Scaffold. Cancers 2020, 12, 1043.
73. De Robertis, M.; Pasquet, L.; Loiacono, L.; Bellard, E.; Messina, L.; Vaccaro, S.; Di Pasquale, R.; Fazio, V.M.; Rols, M.-P.; Teissie, J.; et al. In Vivo Evaluation of a New Recombinant Hyaluronidase to Improve Gene Electro-Transfer Protocols for DNA-Based Drug Delivery against Cancer. Cancers 2018, 10, 405.
74. McMahon, J.M.; Signori, E.; Wells, K.E.; Fazio, V.M.; Wells, D.J. Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase—Increased expression with reduced muscle damage. Gene Ther. 2001, 8, 1264–1270.
75. Serša, G.; Čemažar, M.; Menart, V.; Gaberc-Porekar, V.; Miklavčič, D. Anti-tumor effectiveness of electrochemotherapy with bleomycin is increased by TNF-α on SA-1 tumors in mice. Cancer Lett. 1997, 116, 85–92.
76. Mir, L.M.; Orlowski, S.; Poddevin, B.; Belehradek, J., Jr. Electrochemotherapy tumor treatment is improved by interleukin-2 stimulation of the host’s defenses. Eur. Cytokine Netw. 1992, 3, 331–334.
77. Mir, L.M.; Roth, C.; Orlowski, S.; Quintin-Colonna, F.; Fradelizi, D.; Belehradek, J., Jr.; Kourilsky, P. Systemic antitumor effects of electrochemotherapy combined with histoincompatible cells secreting interleukin-2. J. Immunother. Emphas. Tumor Immunol. 1995, 17, 30–38.
78. Ichim, C.V. Revisiting immunosurveillance and immunostimulation: Implications for cancer immunotherapy. J. Transl. Med. 2005, 3, 8.
79. Prehn, R.T.; Prehn, L.M. The flip side of immune surveillance: Immune dependency. Immunol. Rev. 2008, 222, 341–356.
80. He, Y.; Zha, J.; Wang, Y.; Liu, W.; Yang, X.; Yu, P. Tissue damage–associated “danger signals” influence T-cell responses that promote the progression of preneoplasia to cancer. Cancer Res. 2013.
81. Campana, L.G.; Edhemovic, I.; Soden, D.; Perrone, A.M.; Scarpa, M.; Campanacci, L.; Cemazar, M.; Valpione, S.; Miklavčič, D.; Mocellin, S.; et al. Electrochemotherapy—Emerging applications technical advances, new indications, combined approaches, and multi-institutional collaboration. Eur. J. Surg. Oncol. 2019, 45, 92–102.
82. Mozzillo, N.; Simeone, E.; Benedetto, L.; Curvietto, M.; Giannarelli, D.; Gentilcore, G.; Camerlingo, R.; Capone, M.; Madonna, G.; Festino, L.; et al. Assessing a novel immuno-oncology-based combination therapy: Ipilimumab plus electrochemotherapy. Oncoimmunology 2015, 4, e1008842.
83. Brizio, M.; Fava, P.; Astrua, C.; Cavaliere, G.; Savoia, P. Complete regression of melanoma skin metastases after electrochemotherapy plus ipilimumab treatment: An unusual clinical presentation. Eur. J. Dermatol. 2015, 25, 271–272.
84. Pavlin, D.; Tozon, N.; Sersa, G.; Pogacnik, A.; Cemazar, M. Efficient electrotransfection into canine muscle. Technol. Cancer Res. Treat. 2008, 7, 45–54.
85. Cutrera, J.; Torrero, M.; Shiomitsu, K.; Mauldin, N.; Li, S. Intratumoral bleomycin and IL-12 electrochemogenetherapy for treating head and neck tumors in dogs. Methods Mol. Biol. 2008, 423, 319–325.
86. Reed, S.D.; Fulmer, A.; Buckholz, J.; Zhang, B.; Cutrera, J.; Shiomitsu, K.; Li, S. Bleomycin/interleukin-12 electrochemogene therapy for treating naturally occurring spontaneous neoplasms in dogs. Cancer Gene Ther. 2010, 17, 457–464.
87. Pavlin, D.; Cemazar, M.; Cör, A.; Sersa, G.; Pogacnik, A.; Tozon, N. Electrogene therapy with interleukin-12 in canine mast cell tumors. Radiol. Oncol. 2011, 45, 31–39.
88. Cemazar, M.; Sersa, G.; Pavlin, D.; Tozon, N. Intramuscular IL-12 electrogene therapy for treatment of spontaneous canine tumors. Targets Gene Ther. 2011, 299, 320.
89. Cutrera, J.; King, G.; Jones, P.; Kicenuik, K.; Gumpel, E.; Xia, X.; Li, S. Safe and effective treatment of spontaneous neoplasms with interleukin 12 electro-chemo-gene therapy. J. Cell Mol. Med. 2015, 19, 664–675.
90. Maglietti, F.; Michinski, S.; Emanuela, S.; Tellado, M.; Marshall, G. Electrochemotherapy immune response enhancement by gene electrotransfer using IL-2 and IL-12 genes in canine patients. Eur. J. Cancer 2016, 61, S210.
91. Cicchelero, L.; Denies, S.; Haers, H.; Vanderperren, K.; Stock, E.; Van Brantegem, L.; de Rooster, H.; Sanders, N.N. Intratumoural interleukin 12 gene therapy stimulates the immune system and decreases angiogenesis in dogs with spontaneous cancer. Vet. Comp. Oncol. 2017, 15, 1187–1205.
92. Cemazar, M.; Ambrozic Avgustin, J.; Pavlin, D.; Sersa, G.; Poli, A.; Krhac Levacic, A.; Tesic, N.; Lampreht Tratar, U.; Rak, M.; Tozon, N. Efficacy and safety of electrochemotherapy combined with peritumoral IL-12 gene electrotransfer of canine mast cell tumours. Vet. Comp. Oncol. 2017, 15, 641–654.
93. Cicchelero, L.; Denies, S.; Vanderperren, K.; Stock, E.; Van Brantegem, L.; de Rooster, H.; Sanders, N.N. Immunological, anti-angiogenic and clinical effects of intratumoral interleukin 12 electrogene therapy combined with metronomic cyclophosphamide in dogs with spontaneous cancer: A pilot study. Cancer Lett. 2017, 400, 205–218.
94. Salvadori, C.; Svara, T.; Rocchigiani, G.; Millanta, F.; Pavlin, D.; Cemazar, M.; Lampreht Tratar, U.; Sersa, G.; Tozon, N.; Poli, A. Effects of Electrochemotherapy with Cisplatin and Peritumoral IL-12 Gene Electrotransfer on Canine Mast Cell Tumors: A Histopathologic and Immunohistochemical Study. Radiol. Oncol. 2017, 51, 286–294.
95. Milevoj, N.; Tratar, U.L.; Nemec, A.; Brožič, A.; Žnidar, K.; Serša, G.; Čemažar, M.; Tozon, N. A combination of electrochemotherapy, gene electrotransfer of plasmid encoding canine IL-12 and cytoreductive surgery in the treatment of canine oral malignant melanoma. Res. Vet. Sci. 2019, 122, 40–49.
96. Milevoj, N.; Tozon, N.; Licen, S.; Lampreht Tratar, U.; Sersa, G.; Cemazar, M. Health-related quality of life in dogs treated with electrochemotherapy and/or interleukin-12 gene electrotransfer. Vet. Med. Sci. 2020.
97. Maglietti, F.; Tellado, M.; Olaiz, N.; Michinski, S.; Marshall, G. Minimally Invasive Electrochemotherapy Procedure for Treating Nasal Duct Tumors in Dogs using a Single Needle Electrode. Radiol. Oncol. 2017, 51, 422–430.
98. Mali, B.; Jarm, T.; Snoj, M.; Sersa, G.; Miklavcic, D. Antitumor effectiveness of electrochemotherapy: A systematic review and meta-analysis. Eur. J. Surg. Oncol. 2013, 39, 4–16.
99. Chuang, T.-F.; Lee, S.-C.; Liao, K.-W.; Hsiao, Y.-W.; Lo, C.-H.; Chiang, B.-L.; Lin, X.-Z.; Tao, M.-H.; Chu, R.-M. Electroporation-mediated IL-12 gene therapy in a transplantable canine cancer model. Int. J. Cancer 2009, 125, 698–707.
100. Kamensek, U.; Cemazar, M.; Lampreht Tratar, U.; Ursic, K.; Sersa, G. Antitumor in situ vaccination effect of TNFα and IL-12 plasmid DNA electrotransfer in a murine melanoma model. Cancer Immunol. Immunother. 2018, 67, 785–795.
101. Jacobs, L.; De Smidt, E.; Geukens, N.; Declerck, P.; Hollevoet, K. DNA-Based Delivery of Checkpoint Inhibitors in Muscle and Tumor Enables Long-Term Responses with Distinct Exposure. Mol. Ther. 2020.
102. Turjanski, P.; Olaiz, N.; Maglietti, F.; Michinski, S.; Suárez, C.; Molina, F.V.; Marshall, G. The role of pH fronts in reversible electroporation. PLoS ONE 2011, 6, e17303.
103. Tellado, M.N.; Maglietti, F.H.; Michinski, S.D.; Marshall, G.R.; Signori, E. Electrochemotherapy in treatment of canine oral malignant melanoma and factors influencing treatment outcome. Radiol. Oncol. 2020, 54, 68–78.
104. Tellado, M.N.; Michinski, S.D.; Olaiz, N.; Maglietti, F.; Marshall, G. Canine Oral Eosinophilic Granuloma Treated with Electrochemotherapy. Case Rep. Vet. Med. 2014, 2014, 519197.
105. Suárez, C.; Soba, A.; Maglietti, F.; Olaiz, N.; Marshall, G. The role of additional pulses in electropermeabilization protocols. PLoS ONE 2014, 9, e113413.
106. Marino, M.; Olaiz, N.; Signori, E.; Maglietti, F.; Suárez, C.; Michinski, S.; Marshall, G. pH fronts and tissue natural buffer interaction in gene electrotransfer protocols. Electrochim. Acta 2017, 255, 463–471.
107. Suárez, C.; Soba, A.; Maglietti, F.; Olaiz, N.; Marshall, G. Effects of Pulse Addition in Electropermeabilization: Theoretical Insights on the Electric Conductivity. In Proceedings of the 1st World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental Technologies, Portoroz, Slovenia, 6–10 September 2016; pp. 215–218.
108. Maglietti, F.H.; Michinski, S.D.; Ricotti, I.; Maure, P.; Mir, L.M.; Olaiz, N.; Marshall, G. Amelanotic Melanoma of the Root of the Tongue in A Canine Patient Treated by Electrochemotherapy. J. Anal. Oncol. 2014, 3, 217–221.
109. Rangel, M.M.M.; Luz, J.C.S.; Oliveira, K.D.; Ojeda, J.; Freytag, J.O.; Suzuki, D.O. Electrochemotherapy in the treatment of neoplasms in dogs and cats. Austral J. Vet. Sci. 2019, 51, 45–51.
110. Suzuki, D.O.H. Electrochemotherapy on Bladder—Preliminary Results. Bio. J. Sci. Tech. Res. 2018, 12.1
111. Suzuki, D.O.H.; Berkenbrock, J.A.; de Oliveira, K.D.; Freytag, J.O.; Rangel, M.M.M. Novel application for electrochemotherapy: Immersion of nasal cavity in dog. Artif. Organs 2017, 41, 767–773.
112. Suzuki, D.O.H.; Marques, C.M.G.; Rangel, M.M.M. Conductive Gel Increases the Small Tumor Treatment With Electrochemotherapy Using Needle Electrodes. Artif. Organs 2016, 40, 705–711.
113. Rangel, M.M.M.; Chaible, L.M.; Nagamine, M.K.; Mennecier, G.; Cogliati, B.; de Oliveira, K.D.; Fukumasu, H.; Sinhorini, I.L.; Mir, L.M.; Dagli, M.L.Z. Electroporation transiently decreases GJB2 (connexin 26) expression in B16/BL6 melanoma cell line. J. Membr. Biol. 2015, 248, 47–52.
114. Suzuki, D.O.H.; Berkenbrock, J.A.; Frederico, M.J.S.; Fátima, R.M.; Rangel, M.M.M. Oral Mucosa Model for Electrochemotherapy Treatment of Dog Mouth Cancer: Ex Vivo, In Silico, and In Vivo Experiments. Artif. Organs 2018, 42, 297–304.
115. Miklavcic, D.; Pucihar, G.; Pavlovec, M.; Ribaric, S.; Mali, M.; Macek-Lebar, A.; Petkovsek, M.; Nastran, J.; Kranjc, S.; Cemazar, M.; et al. The effect of high frequency electric pulses on muscle contractions and antitumor efficiency in vivo for a potential use in clinical electrochemotherapy. Bioelectrochemistry 2005, 65, 121–128.
116. Kotnik, T.; Mir, L.M.; Flisar, K.; Puc, M.; Miklavcic, D. Cell membrane electropermeabilization by symmetrical bipolar rectangular pulses. Part I. Increased efficiency of permeabilization. Bioelectrochemistry 2001, 54, 83–90.
117. Lanza, A.; Baldi, A.; Rossi, G.; Spugnini, E.P. Electrochemotherapy for the treatment of an incompletely excised subcutaneous low-grade epithelioid hemangioendothelioma in a budgerigar parakeet (Melopsittacus undulatus). Open Vet. J. 2019, 9, 269–272.
118. Spugnini, E.P.; Lanza, A.; Sebasti, S.; Baldi, A. Electrochemotherapy palliation of an oral squamous cell carcinoma in an African hedgehog (Atelerix albiventris). Vet. Res. Forum 2018, 9, 379–381.
119. Racnik, J.; Svara, T.; Zadravec, M.; Gombac, M.; Cemazar, M.; Sersa, G.; Tozon, N. Electrochemotherapy with Bleomycin in the Treatment of Squamous Cell Carcinoma of the Uropygial Gland in a Cockatiel (Nymphicus Hollandicus). J. Exot. Pet Med. 2019, 29, 217–221.
120. Racnik, J.; Svara, T.; Zadravec, M.; Gombac, M.; Cemazar, M.; Sersa, G.; Tozon, N. Electrochemotherapy with Bleomycin of Different types of Cutaneous Tumours in a Ferret (Mustela Putorius Furo). Radiol. Oncol. 2018, 52, 98–104.
121. Stewart, T.H.M.; Heppner, G.H. Immunological enhancement of breast cancer. Parasitology 1997, 115, 141–153.
122. Prehn, R.T. The Immune Reaction as a Stimulator of Tumor Growth. Science 1972, 176, 170–171.
123. Parmiani, G.; Maccalli, C. The early antitumor immune response is necessary for tumor growth. OncoImmunology 2012, 1, 930–934.
124. Jenkins, R.W.; Barbie, D.A.; Flaherty, K.T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. Br. J. Cancer 2018, 118, 9–16.
125. Parakh, S.; King, D.; Gan, H.K.; Scott, A.M. Current Development of Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy. Curr. Immun. Strateg. Cancer 2020, 1–70.
126. Andrews, A. Treating with Checkpoint Inhibitors-Figure $1 Million per Patient. Am. Health Drug Benefits 2015, 8, 9.
127. Sultan, F.; Ganaie, B.A. Comparative oncology: Integrating human and veterinary medicine. Open Vet. J. 2018, 8, 25–34.
128. Pinho, S.S.; Carvalho, S.; Cabral, J.; Reis, C.A.; Gärtner, F. Canine tumors: A spontaneous animal model of human carcinogenesis. Transl. Res. 2012, 159, 165–172.
129. Rowell, J.L.; McCarthy, D.O.; Alvarez, C.E. Dog models of naturally occurring cancer. Trends Mol. Med. 2011, 17, 380–388.

* “Electroporation as the Immunotherapy Strategy for Cancer in Veterinary Medicine: State of the Art in Latin America” isimli makalenin Türkçe çevirisidir. Makalenin orijinalini okumak için tıklayın.