Doğal Sebeplerle Oluşan, BRAF mutasyonlu Ürotelyal Karsinomlu Köpeklerde Faz I/II Vemurafenib Deneyi

P. Rossman ve T.S. Zabka bu makalenin ilk yazarları, D. Dhawan ve D.W. Knapp ise yardımcı kıdemli yazarları olarak katkıda bulunmuşlardır.
P. Rossman için güncel adres: Güney Carolina Veterinerlik Uzmanları ve Acil Bakım, Columbia, Güney Carolina.
Sorumlu Yazar: Deborah W. Knapp, Purdue Üniversitesi, Veteriner Klinik Bilimleri Bölümü, 625 Harrison St., West Lafayette, IN 47907-2026.
Telefon: 765-494-9900 765-494-9900; Faks: 765-496-1108; E-posta: knappd@purdue.edu
Mol Cancer Ther 2021;20:2177-88
doi: 10.1158/1535-7163.MCT-20-0893
2021 Amerikan Kanser Araştırmaları Derneği

Vemurafenib (Zelboraf) dahil olmak üzere BRAF hedefli tedaviler kanserde ciddi bir remisyon sağlar; ancak genellikle ilaç direnci ortaya çıkar. Amaç, BRAF hedefli tedaviyi geliştirmek için deneysel modelleri tamamlamak üzere insan kanserinin karmaşık özelliklerini barındıran doğal olarak oluşan bir köpek kanseri modelini karakterize etmekti. İnsan BRAFV600E’nin köpek homoloğunu barındıran doğal olarak ortaya çıkan invaziv ürotelyal karsinomlu (InvUC) evcil köpeklerde faz I/II vemurafenib klinik çalışması gerçekleştirilmiştir. Güvenlik, Tolere Edilebilir Maksimum Doz (MTD), farmakokinetik ve antitümör aktivite gibi veriler tespit edilmiştir. Sinyalizasyon ve immün gen ekspresyonundaki değişiklikler, tedavi öncesinde, tedavi sırasında ve progresyonda alınan sistoskopik biyopsilerin RNA sekanslama ve fosfo proteomik analizleri ile değerlendirilmiştir. Vemurafenib MTD günde iki kez 37.5 mg/kg idi. Anoreksi en sık görülen yan etkiydi. MTD’de, 24 köpeğin 9’unda (%38) kısmi remisyon görüldü ve ortalama progresyonsuz geçen süre 181 gündü (aralık, 53- 608 gün).

Mutasyona uğramış BRAF, özellikle de MAPK yolunun yapısal aktivasyonuna neden olan BRAFV6000E, kanser tedavisi için umut verici bir hedef teşkil etmektedir (1). MAPK yolağı aktivasyonu, hücre çoğalması ve sağkalımının artmasına, apoptozdan kaçınılmasına ve kanser gelişimi ve ilerlemesini kolaylaştıran immün inhibitör süreçlerin ortaya çıkmasını sağlar (1–4). BRAFV600E, metastatik melanomlu hastaların %50’si ve mesane, tiroid, karaciğer, kolon, yumurtalık, akciğer ve pan-kreatik kanserli hastaların daha küçük alt grupları dahil olmak üzere tüm insan kanserlerinin %8’inde önemli bir faktördür (5–9). BRAFV600E’nin hedeflenmesi başta melanom olmak üzere ilerlemiş kanserlerde ciddi remisyon sağlamış olsa da, tedaviye karşı doğuştan gelen ve sonradan kazanılan direnç sıklıkla görülmektedir (2–5, 9). Kolorektal ve tiroid karsinomları gibi BRAF mutasyonlarına sahip diğer kanserler BRAF hedefli tedaviye daha az yanıt verir (8, 9). Direnç, klasik MAPK yolunun reaktivasyonu veya alternatif sinyal yollarının aktive edilmesi ile ortaya çıkabilir (2–5, 10–13). Çok sayıda çalışma, BRAF hedefli tedavilerin başarısında ve başarısızlığında immün yanıtın kilit bir rol oynadığını da göstermektedir (2–5, 10–14). Ancak hastaların çoğunda nüksün nedeni bilinmemektedir (2, 3, 5). İlacın başarısız olma mekanizmalarını daha iyi anlamaya ve atlatmaya yönelik çalışmalar son derece yüksek öncelik taşımaktadır.

Düzenli kontrollü çalışmalarda kullanılan deneysel hayvan modellerinin BRAF hedefli tedaviye direnç mekanizmalarının değerlendirilmesinde etkili olduğu açıktır (3, 7, 10, 15). Ancak bu modeller genellikle insan kanserinin karmaşıklığını temsil etmekte başarısız olmaktadır (16). İnsanlarda hedefe yönelik tedavilerin başarısını ve başarısızlığını daha iyi anlamak ve tedaviyi iyileştirmek ve kişiselleştirmek için kanser heterojenliği, mutasyonel yapı, agresif metastatik davranış ve konakçı immünokompetansı dahil olmak üzere insan kanserinin çeşitli özelliklerini içeren tamamlayıcı modellere ihtiyaç vardır. Bu karmaşık özellikler, doğal olarak oluşan bir kanser modelinde, invaziv idrar kesesi kanseri, özellikle de invaziv ürotelyal karsinom (InvUC; ref. 17) olan evcil köpeklerde mevcuttur. Köpek InvUC’si, insan InvUC’sinin moleküler alt tiplerini barındıran, lokal olarak agresif ve vakaların %50’sinde akciğer, karaciğer ve kemik gibi uzak bölgelere metastatik olan yüksek gradeli, heterojen bir kanserdir (17–19). İlginç bir şekilde, köpek InvUC’un >%80’i insan BRAFV600E’nin köpek homoloğu olan BRAFV595E mutasyonunu barındırmaktadır (17, 20, 21).

Köpek InvUC hücreleri, IC50 değerleri mmol/L aralığında olmasına rağmen, BRAFV600E’yi hedef alan ilaçlar tarafından in vitro olarak öldürülmektedir (20, 22). Bu konsantrasyonlar, insan melanom hücrelerini öldüren nmol/L konsantrasyonlarının aksine, kolon ve tiroid karsinom hücrelerini öldürmek için gerekenlere daha yakındır (5, 8, 9). Bu bulgular ve çalışma sırasında birden fazla noktada köpeklerden sistoskopik tümör biyopsileri alma fırsatı ve evcil köpeklerde klinik çalışmaların olumlu kabul görmesi, BRAF hedefli tedaviyi incelemek ve geliştirmek için bir model olarak köpek InvUC’unu doğrulamaya olan ilgiyi artırmıştır (17). Köpek modelinin uygunluğunun belirlenmesine yardımcı olmak için, BRAF mutasyona uğramış InvUC’lu köpeklerde BRAF hedefli bir ilaç olan vemurafenibin etkilerini araştırmak üzere bir klinik çalışma gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma şunları içermektedir: (i) vemurafenibin güvenliğinin, MTD’sinin, farmakokinetiğinin ve antitümör aktivitesinin değerlendirilmesi, (ii) tedavi süresince kanserin moleküler düzeyde karakterizasyonu ve (iii) insanlarda bildirilen bulgularla karşılaştırılarak hedef etkileşiminin ve potansiyel vemurafenib duyarlılığı ve direnci mekanizmalarının değerlendirilmesi.

MATERYAL VE METOD

Çalışmaya genel bakış
Purdue Üniversitesi Veteriner Hekimliği Hastanesinde (PUVTH, West Lafayette, IN), Purdue Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesinin onayı ve bilgilendirilmiş hasta sahibi onamı ile BRAFV595E barındıran doğal olarak ortaya çıkan InvUC’ye sahip evcil köpeklerde faz I/II vemurafenib klinik çalışması gerçekleştirilmiştir. Evcil köpekler evde yaşamış ve değerlendirme için PUVTH’ye ziyaretler gerçekleştirmiştir. Sistoskopik biyopsiler tedaviden önce, tedavi sırasında ve kanser ilerlemesinde alınmıştır. Transkriptomik değişiklikleri değerlendirmek için RNA dizileme (RNA-sekans) analizleri ve fosforile proteinleri ve zaman içindeki değişiklikleri tespit etmek için fosfoproteomik ve IHC analizleri yapılmıştır. Vemurafenib konsantrasyonları plazma ve tümör dokularında ölçülmüştür.

Denek uygunluğu
Katılımcı köpekler için dahil edilme kriterleri şunlardı: BRAFV595E’nin damlacıklı dijital PCR (21) ile idrarda tespit edildiği ölçülebilir histolojik olarak teşhis edilmiş alt üriner sistem InvUC varlığı, beklenen sağkalım ≥ 6 hafta ve serum kreatinin <2.0 mg/dL (normal referans aralığı, 0.5-1.5 mg/dL). Kemoterapi için 4 haftalık ve siklooksijenaz (COX) inhibitörleri için 5 günlük bir arınma süresi gerekmiştir. Çalışma sırasında, köpek InvUC’una (17, 23) karşı antitümör aktiviteye sahip olabilen COX inhibitörleri de dahil olmak üzere diğer tedavilere izin verilmemiştir.

Tedavi ve deney tasarımı
Vemurafenib (Zelboraf, 240 mg tablet, Genentech), laboratuvar köpeklerinde daha önce yapılan güvenlik ve farmakokinetik çalışmalara dayanarak, günde iki kez 25 mg/kg başlangıç dozunda oral olarak tam ve yarım tabletler halinde gıda ile birlikte uygulanmıştır. İlaç tolerabilitesi tıbbi öykü, fizik muayene, tam kan sayımı ve serum biyokimya profilleri ile değerlendirilmiştir. Vemurafenib dozu, 3+3 deney tasarımı kullanılarak sonraki kohortlarda günde iki kez 25 mg/kg artırılmıştır. Doz sınırlayıcı toksisite (DLT), (VCOG-CTCAE grade 3 veya 4 toksisite; ref. 24) ortaya çıktığında, kohort 6 köpeğe genişletilmiş ve doz, 6 köpekten 1’inden fazlasında DLT görülmeyen doz olan MTD’yi belirlemek için daha ileri düzeyde ayarlanmıştır. Serum alanin amino transferazda (ALT) grade 3 anormallikler DLT olarak kabul edilmemiştir, çünkü karaciğer fonksiyon bozukluğu olmadan ALT artışı laboratuvar köpeklerinde ve vemurafenib alan insanlarda yaygındır (25). Sistoskopi, vemurafenib öncesinde (vemurafenib öncesi), 1 aylık vemurafenib sonrasında (vemurafenib-1 aylık) ve mümkün olduğunda kanser ilerlediğinde (vemurafenib-PD; ref. 26) daha önce tarif edildiği şekilde gerçekleştirilmiştir. Biyopsi bölgesinde tutarlılık için, sistoskopi ve ultrasonografi görüntülerini içeren tümör haritası rehberliğinde her sistoskopi aynı operatör tarafından gerçekleştirilmiştir. Bireysel köpeklerde, vemurafenib dozu grade 2 toksisite için %10 ve grade 3 veya daha yüksek toksisite için %20 azaltılmıştır. Doz ayarlamalarını takiben kanser progresyonu veya kabul edilemez düzeyde toksisite yaşayan köpekler çalışma dışında başka tedaviler almaya uygun bulunmuştur.

Primer tümöre karşı antitümör etkiler 4 haftalık aralıklarla standardize sistosonografi (27) ve üretra, prostat ve komşu düğümlerin rektal palpasyonunu içeren fizik muayene ile değerlendirilmiştir. Torasik radyografi (üç çekim), abdominal radyografi (iki çekim) ve abdominal ultrasonografi 8 haftalık aralıklarla yapılmıştır. Primer tümör yanıtları şu şekilde tanımlanmıştır: tam remisyon (CR, rezidüel kanser saptanmadı), kısmi remisyon (PR, tümör hacminde ≥%50 azalma ve yeni tümör lezyonu yok), stabil hastalık (SD, tümör hacminde <%50 değişiklik ve yeni tümör lezyonu yok) ve ilerleyici hastalık (PD, tümör hacminde ≥%50 artış veya yeni tümör lezyonu gelişimi; ref. 28). Metastazlar RECIST ile değerlendirilmiştir (29). Ölüm anında nekropsi yapmak için izin istenmiştir.

Farmakokinetik analizler
Kan, 1. günde ve tedavinin 2. ve 4. haftalarında, sabah vemurafenib dozundan önce ve faz I aşamasında dozlamadan 1, 3, 6 ve 10 saat sonra ve çalışmanın faz II aşamasında sabah dozundan önce ve dozlamadan 3 ve 6 saat sonra toplanarak lityum antikoagülan içeren tüplere alınmıştır. Plazma, yüksek performanslı LC/MS-MS ile analiz edilene kadar -80◦C’de saklanmıştır (30). Vemurafenib konsantrasyonları ayrıca vemurafenib-1-ay ve vemurafenib-PD’de eşleştirilmiş tümör dokularında ve kanda ölçülmüştür.

Örneklem büyüklüğü ve istatistiksel faktörler
Tümör yanıtını tahmin etmek için yirmi dört köpek MTD’de tedavi edilmiştir (31). Olası öngörücü değişkenler (yaş, cinsiyet, InvUC için yüksek riskli ırk, tümör evresi, grade, BRAF mutasyon fraksiyonu, moleküler alt tip, ilaç dozu, ilaç konsantrasyonları, toksisiteler) ile tümör yanıtı ve progresyonsuz geçen süre (PFI, vemurafenib başlangıcından PD’ye kadar geçen süre) arasındaki ilişkileri değerlendirmek için adımsal Cox regresyon analizi yapılmıştır. Tek değişkenli ve çok değişkenli modeller uygulanmıştır. Öngörücü değişkenler ile tümör yanıtı veya ölüm sırasındaki uzak metastazlar arasındaki ilişkiler lojistik regresyon modelleri ile değerlendirilmiş, OR’ler ve %95 güven aralıkları (CI) hesaplanmıştır. Öngörücü değişkenler ile PFI, vemurafenib ile ilişkili sağkalım (vemurafenib başlangıcından ölüme kadar) ve genel sağkalım (OS, tanıdan ölüme kadar) arasındaki ilişkileri incelemek için Cox oransal tehlike modelleri oluşturulmuş ve HR’ler ve %95 CI’ler hesaplanmıştır. Eşleştirilmiş plazma ve tümör vemurafenib konsantrasyonları arasındaki ilişkinin gücünü ve yönünü belirlemek için Pearson korelasyon katsayısı kullanılmıştır. 0,1-0,3 korelasyon zayıf, 0,31-0,5 orta ve >0,5 güçlü korelasyon olarak kabul edilmiştir.

RNA-sekans analizleri
RNA-sekans analizleri, vemurafenibin antitümör etkileri ve direnci ile potansiyel ilgisi olan genleri, yolakları, moleküler alt tipi ve immün sınıflandırmayı tanımlamak için daha önce tarif edildiği şekilde gerçekleştirilmiştir (18). Sistoskopik tümör örnekleri hemen TRIzol (Sigma) içine yerleştirilmiş ve RNA izole edilip saflaştırılmıştır (RNeasy, Qiagen). Normal mesane mukozası kontrol örnekleri, mesane hastalığı olmayan ve başka nedenlerle ötenazi uygulanan köpeklerden nekropsi sırasında toplanmıştır. Tümör örnekleri Q2 Solutions tarafından gruplandırılmış ve işlenmiştir. Yönlü RNA-sekans dizinleri oluşturuldu, doğrulandı ve bir Illumina HiSeq sisteminde çalıştırılarak 2 × 150 eşleştirilmiş son okuma ile örnek başına > 30 × 106 küme elde edildi.

RNA-sekans analizleri Strand NGS (Agilent Technologies) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ham sekans kalite kontrol ve filtrelemeden geçirilmiş ve köpek genomu CanFam3.1 (Kaliforniya Üniversitesi, Santa Cruz Genom Veritabanı) ile hizalanmıştır. Normal mesane ve InvUC arasında farklı şekilde ifade edilen genler vemurafenib öncesi, vemurafenib-1 ay ve vemurafenib-PD’de değerlendirilmiştir. Üç zaman noktasında genlerin DESEQ normalize edilmiş verilerine DESEQ2 ve TMM normalize edilmiş verilerine edge R (“fold” (kat) değişikliği ≥2, Pcorr < 0.05) uygulanarak diferansiyel ekspresyonu tespit etmek için yanıt grupları arasında ikili karşılaştırma kullanılmıştır (32). Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ve Gene Ontology (GO) analizleri yapılmıştır. RNA-sekans verileri ayrıca özellikle şunlar için sorgulanmıştır: MAPK sinyalinde yer alan genler ve vemurafenib tedavi sonuçlarıyla ilişkili olduğu bildirilen genler (2–5, 10–13, 33), InvUC’yi luminal ve bazal moleküler alt tiplere atamak için kullanılan genler (18, 19, 34) ve tümör bağışıklık durumunu karakterize etmek için kullanılan genler (35). Bağışıklıkla ilişkili genler, insan mesane kanserini T hücresi iltihaplı olmayan (T lenfositleri tarafından infiltre edilmemiş, immün “soğuk”) veya T hücresi iltihaplı (T lenfositleri tarafından infiltre edilmiş, immün “sıcak”; ref. 35) olarak sınıflandırdığı bildirilen genlerdi. Her tümörde ifade edilen immün genlerin yüzdesine dayanan yarı kantitatif bir yaklaşım, her tümöre aşağıdaki gibi bir “immün skor” atamak için kullanılmıştır: 1 ¼ soğuk, 2 ¼ soğuk, 3 ¼ nötr, 4 ¼ sıcak ve 5 ¼ sıcak. Ek analizlerde, CIBERSORT (Alizadeh Lab, Stanford Üniversitesi, Stanford, CA) immün infiltrat içindeki spesifik immün hücre tiplerinin yoğunluklarını tahmin etmek için kullanılmıştır (36). RNA-seq verileri ve ilişkili klinik veriler NCI’nin Integrated Canine Data Commons’ında depolanmıştır: Erişim Kimliği ICDC000004.

Fosfoproteomik analiz
Biyopsi örnekleri homojenize edilmiş, proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile muamele edilmiş ve fosfopeptit zenginleştirme için 500 mg protein kullanılmıştır. İndirgenmiş, alkillenmiş ve tripsinle sindirilmiş peptitler tuzdan arındırılmış (Pierce Peptide desalting spin columns, Thermo Fisher Scientific) ve daha önce tarif edildiği gibi fosfopeptitler (Spin-Tip PolyMAC Phosphopeptide Enrichment kit, Tymora Analytical) için zenginleştirilmiştir (37). Örnekler Q Exactive High Field Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific; ref. 37) ile birleştirilmiş bir Dionex UltiMate 3000 RSLC Nano Sistemi ile analiz edilmiştir. LC/MS-MS ham verileri MaxQuant kullanılarak Canis familiaris protein veritabanında aranmış ve MaxQuant çıktısı Perseus yazılımı ile analiz edilmiştir (38, 39). “Kontaminant”, ‘ters’ ve ‘yalnızca bölge ile tanımlanan’ olarak nitelenen proteinler ve fosfositler filtrelenmiştir. Örnekler gruplandırılmış ve en az bir grupta iki veya daha fazla replikatta bulunan proteinler daha ileri düzey analizler için muhafaza edilmiştir. Eksik değerler normal dağılıma dayalı değerlerle değiştirildi ve istatistiki anlamlılık analizi için ANOVA testi kullanıldı.

IHC (immünhistokimya)
Fosforile ERK’yi (pERK; Klon 137F5, Hücre Sinyal Teknolojisi) tespit etmek için IHC, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü InvUC kesitlerinde gerçekleştirilmiştir. İmmünoreaktif tümör hücrelerinin yüzdesi ve boyanma yoğunluğu kaydedilmiştir (40, 41).

Sonuçlar
Kayıt, MTD, yan etkiler ve farmakokinetik Çalışmaya kaydedilen 34 köpeğin denek ve tümör özellikleri Tablo 1’de özetlenmiştir. Diğer dört köpek çalışma için sunulmuş ancak kayıt kriterlerini karşılamamıştır. Vemurafenibin MTD’si oral yoldan günde iki kez 37,5 mg/kg idi. Üç, 5 ve 6 köpek sırasıyla 25, 50 ve 37.5 mg/kg ile tedavi edilmiş ve DLT’ler gastrointestinal rahatsızlık olmuştur. MTD’nin üzerindeki en yaygın yan etki anoreksiyadır (3 köpekte grade 2, 2 köpekte grade 3).

Plazma (mg/mL) ve tümör dokusundaki (mg/g) vemurafenib konsantrasyonları.
A: Üç doz kohortunda (25, 37,5 ve 50 mg/kg) köpeklerde ilk vemurafenib dozunu takiben plazma konsantrasyonları rapor edilmiştir.
B: Vemurafenib plazma ve tümör dokusu konsantrasyonları pozitif bir korelasyonla raporlanmıştır (R2¼ 0,2517).
C: PR, SD ve PD’li köpeklerde tedavinin 2. haftasında kısmi EAA’dan (Css) hesaplanan kararlı durumdaki plazma vemurafenib konsantrasyonları önemli değişkenlikler kaydedilerek rapor edilmiştir. Örneğin, tedavinin 2. haftasında, 37,5 mg/kg vemurafenib alan 26 köpek için ortalama SD vemurafenib konsantrasyonları şöyleydi: Sabah dozundan önce 16,1 12,0 mg/mL, Cmaks değerinde 24,8 13,2 mg/mL ve Css değerinde 20,3 11,4 mg/mL.
D: 1 aylık vemurafenib tümör dokusu konsantrasyonları PR, SD ve PD’li köpekler için listelenmiştir. Ne doku ne de plazma konsantrasyonları toksisite veya antitümör aktivite ile korelasyon göstermemiştir. Emilime yardımcı olmak ve değişkenliği azaltmak için vemurafenib yiyecekle birlikte verilmesine rağmen 4. haftada vemurafenib konsantrasyonlarında benzer değişkenlik gözlenmiştir. Köpekler vemurafenibin ilk gününde başlangıç farmakokinetik eğrisi için tutarlı bir diyetle beslenmiştir; diyet 1. günden sonra standardize edilmemiştir. Test için kantitasyonun alt sınırı plazmada 9 ng/mL ve dokuda 9 ng/g idi.

ŞEKİL 2 
Vemurafenib tedavisi sırasında her bir köpekte başlangıçtan itibaren tümör hacmindeki değişikliklerin şelale grafiği. PR (tümör hacminde ≥%50 azalma) köpeklerin %39’unda ve SD (tümör hacminde <%50 değişiklik) dozlar arasında köpeklerin %58’inde meydana gelmiştir. Vemurafenib tedavisinin 1 ay öncesi ve sonrasındaki ortalama tümör hacmi sırasıyla 6,4 ve 3,1 cm3’tür ve tüm köpekler tedavinin başlangıcında ölçülebilir hastalığa sahiptir. 50 mg/kg vemurafenib alan köpeklerin 4’ünde de yan etkiler nedeniyle vemurafenib tedavisine başladıktan sonraki 4 hafta içinde ≥%20 doz azaltımı yapılmıştır. Bu köpekte tümör yanıtı, akciğer metastazlarının gelişmesi nedeniyle PD olarak sınıflandırılmıştır.

Farmakokinetik analizlerin sonuçları Şekil 1’de özetlenmiştir ve köpekler arasında önemli farklılıklar kaydedilmiştir. İki köpek sahibi, zaman zaman vemurafenib haplarını dışkıda büyük ölçüde bozulmamış olarak bulduklarını bildirmiş ve bu da ilaç emiliminde tutarsızlıklara işaret etmiştir.

Doz grupları arasında 31 köpekteki tümör yanıtları, MTD’de tedavi edilen 24 köpeğin %38’inde PR ve %54’ünde SD dahil olmak üzere Şekil 2’de özetlenmiştir. Vemurafenib, tümör yanıtı belirlenemeden önce gastrointestinal toksisite nedeniyle 3 köpekte kesilmiştir. Remisyon olasılığı artan vemurafenib dozu ile anlamlı olarak artmış (OR, 1.16; %95 CI, 0.99-1.35; P ¼ 0.019) ve yüksek riskli ırk köpeklerde (%53) diğer köpeklere (%25; OR, 3.43; %95 CI, 0.75-15.67; P ¼ 0.103) kıyasla anlamlı olmayan bir artış eğilimi göstermiştir. Ortalama PFI, 37,5 mg/kg vemurafenib alan köpekler için 181 gün (aralık, 53-608 gün) ve tüm köpekler için 179 gün (aralık, 29-767 gün) olmuştur (Ek Şekil S2). Vemurafenib başarısızlığını takiben 19 köpek COX inhibitörleri ve 10 köpek kemoterapi artı COX inhibitörleri almıştır. Vemurafenib ile ilişkili ortalama sağkalım 272 gün (aralık, 18-1.252 gün) ve ortalama OS 354 gün (aralık, 19-1.272 gün) olup çalışmanın sonunda 2 köpek hayatta kalmıştır (Ek Şekil S2). Erkek köpeklerin vemurafenib ile ilişkili sağkalım süresi (ortalama, 314 gün; aralık, 42-980 gün) dişi köpeklere göre (ortalama, 187 gün; aralık, 18-1,252 gün; HR, 0.36; %95 CI, 0.14-0.91; P ¼ 0.031) önemli ölçüde daha uzundu. Vemurafenib öncesinde başka tedaviler almış olan köpeklerin OS süresi (ortalama 398 gün; dağılım, 127-1.261 gün), daha önce tedavi almamış olan köpeklere göre (ortalama 258 gün; dağılım, 19-1.272 gün; HR, 0,22; %95 GA, 0,07-0,75; P ¼ 0,011) daha uzundu.

Ölüm sırasında tümör-nod-metastaz evresi bilinen 26 köpeğin 14’ünde (%54), nekropsi yapılan 21 köpek de dahil olmak üzere, uzak metastazlar mevcuttu. Metastazlar erkek köpeklerde (11/14 köpek, %79) dişi köpeklere (4/12 köpek, %33; OR, 5.83; %95 CI, 0.98-34.64; P = 0.042) kıyasla önemli ölçüde daha yaygındı, ancak kanserin prostatik tutulumu olan erkek köpekler ile olmayanlar arasında farklılık göstermedi. Uzak metastazlar PR olan köpeklerde (%50) PR olmayanlara göre (%79; P = 0.020) daha az yaygındı.

Sinyal yollarında ve spesifik genlerde değişiklikler
RNA-sekans, fosfoproteom ve IHC analizleri
Tümör dokuları RNA-sekans analizleri için vemurafenib öncesi 29 köpekten, 1 aylık vemurafenib döneminde 25 köpekten ve vemurafenib-PD döneminde 17 köpekten elde edilmiştir. IPA ve GO analizlerinde, farklı şekilde ifade edilen genler sinyal yolları, bağışıklık süreçleri, membran kanalları, taşıyıcı aktivitesi, hücre metabolizması ve enerji ile ilişkilendirilmiştir (Ek Tablo S1). Klasik MAPK, stres-JNK ve PI3K/AKT/mTOR yolaklarındaki ve vemurafenib direnciyle bağlantılı diğer genlerdeki (2–5, 10–13, 44) değişiklikleri gözlemlemek için ısı haritaları oluşturulmuş ve vakalar içinde ve arasında heterojenlik kaydedilmiştir (Şekil 3; Ek Şekil S3; Ek Tablo S2). Vemurafenib öncesi tüm köpeklerde bir veya daha fazla MAPK yolağı geni yükselmiştir (Şekil 3).

BRAF’ın downstream’i ve MAPK yolağı aktivitesinin bir belirteci olan ERK, 25 vakanın 22’sinde bir dereceye kadar yükselmiştir (Şekil 3; Ek Şekil S4). ERK ekspresyonu bu 22 vakanın 20’sinde vemurafenib 1. ayda azalmış ve vemurafenib PD’de mevcut örnekleri olan 17 köpeğin 10’unda artmıştır (Ek Şekil S4). BRAF ekspresyonu vemurafenib öncesi 25 vakanın 10’unda yükselmiştir (Şekil 3; Ek Şekil S4). BRAF ekspresyonu bu 10 köpeğin 9’unda 1 aylık vemurafenibe kadar azalmış ve vemurafenib-PD’de örnekleri mevcut olan 17 köpeğin 10’unda artmıştır. BRAF ve ERK ekspresyonundaki değişiklikler tümör yanıtı ile ilişkili bulunmamıştır. Vemurafenib tedavisi ile RRAS, MRAS ve PI3K/AKT/mTOR yolağı genlerinde genel bir artış ve NRAS ekspresyonunda bir azalma görülmüştür (Şekil 3). CCND1, PDGFRB, EGFR, AXL ve EphA2’nin artmış ekspresyonu ve progresyonda PTEN ve NF1 kaybı dahil olmak üzere vemurafenib direncinde rol oynayan diğer genlerdeki değişiklikler köpeklerin alt gruplarında kaydedilmiştir (Şekil 3; Ek Tablo S2; refs. 2, 3, 12, 13, 44). Ne başlangıçtaki idrar BRAF mutasyon fraksiyonu (PR’li köpeklerde ortalama %32, SD/PD’li köpeklerde %25) ne de tedavi sırasındaki değişiklikler sonuçla ilişkilendirilmiştir.

Şekil 3. Köpek InvUC. Köpek InvUC, klasik MAPK yolu (A), Stres-JNK yolu (B) ve PI3K/AKT/mTOR yolu (C) dahil olmak üzere vemurafenib aktivitesi ve direncinde rol oynayan MAPK ile ilişkili yollardaki genlerin RNA-sekans analizleri ve BRAF hedefli tedaviye dirençte rol oynadığı bildirilen diğer genler (D; refs. 2–5, 10–13, 44). RNA-sekans analizleri, normal köpek mesane mukozası (n = 4 köpek) ile karşılaştırmalı olarak vemurafenib öncesi, vemurafenib-1 aylık ve vemurafenib-PD’de sistoskopik biyopsi yoluyla elde edilen 17 köpekten alınan InvUC örnekleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Veriler TMM ve DESeq kullanılarak normalize edilmiş ve istatistiksel analizler sırasıyla edge R ve DESeq2 kullanılarak gerçekleştirilmiş ve veriler ısı haritası ile görselleştirme için bir araya getirilmiştir. Her sütun bir örnekten alınan verileri temsil etmektedir ve örnekler zaman noktasına göre gruplandırılmıştır (bkz. anahtar). Vakalar her zaman noktası için aynı sırada listelenmiştir. Biyopsilerin yalnızca bu iki zaman noktasında mevcut olduğu 25 vaka dahil edildiğinde vemurafenib öncesi ve 1 aylık vemurafenib için de benzer sonuçlar bulunmuştur (Ek Şekil S3).

Moleküler alt tipler
Vemurafenib öncesi RNA-sekans verileri incelendiğinde dokuz bazal ve 20 luminal alt tip tümör tespit edilmiştir (Ek Şekil S6). Erkek köpekler, dokuz vakadan biri erkek olmak üzere bazal tümör grubunda daha az temsil edilirken, lüminal tümör grubunda temsil edilmemiştir (11 erkek, 9 dişi köpek). Remisyon oranı bazal tümörlü köpekler (%33) ile luminal tümörlü köpekler (%44; OR, 0,63; %95 GA, 0,12-3,32; P = 0,5772) arasında anlamlı farklılık göstermemiştir. Vemurafenib-PD’de bazal alt tip, aşağıda tartışılan immün değişikliklerden bağımsız olarak çok değişkenli analizlerde daha kısa PFI (HR, 11.08; %95 CI, 0.95-129.6; P = 0.055) ve ölümde daha yüksek uzak metastatik orana eğilimi (OR, 5.25; %95 CI, 0.4-68.9; P = 0.1787) ile ilişkilendirilmiştir.

RNA-sekans verilerinde bağışıklık belirtileri
İnsan InvUC’unun (35) bağışıklık durumunu sınıflandırmak için kullanılan bağışıklık ile ilgili genlerin (n = 1.797 gen) ekspresyonu Şekil 5’te özetlenmiştir. Tanı sırasındaki RNA-sekans immün skorları en soğuktan en sıcağa doğru sıralanmıştır: 1 (n = 3 köpek), 2 (n = 7), 3 (n = 7), 4 (n = 9) ve 5 (n = 3). Önemli farklılıklar bulunmamasına rağmen, ortalama PFI, bağışıklık skoru ≤2 olan köpekler için 152 gün (aralık, 82-482 gün) ve bağışıklık skoru ≥4 olan köpekler için 248 gün (aralık, 53-605 gün) olmuştur. İmmün skoru ≥4 olan 11 köpeğin 4’ünde (%45) ve immün skoru ≤2 olan 9 köpeğin 3’ünde (%33) remisyon meydana gelmiştir. Vemurafenib öncesi daha yüksek tümör immün skoru bazal alt tip ile ilişkilendirilmiştir (Şekil 5). İmmün skoru ≥4 olan 12 tümörün dokuzu (%75) bazal ve üçü (%25) lüminaldi. İmmün skoru ≤3 olan 17 tümörün tamamı lüminaldi (Şekil 5).

Şekil 4.
Vemurafenib deneyindeki köpeklerden alınan InvUC doku örneklerinin fosfoproteom analizi (AveB) veIHC(C-F). A, Çeşitli kinazların ve moleküler hedeflerinin fosfositleri (BRAF hariç hepsi önemli ölçüde) 1. ayda azalma ve kanser ilerlemesinde geri tepme ile birlikte regüle edilmiştir. BRAF proteini için Cohens’d etki büyüklüğü 1. ayda 0,3 ve kanser ilerlemesinde þ0,6 olmuştur (Ek Şekil S4). BRAF’a ek olarak, CAMKK2’de S121 ve S125 olmak üzere iki bitişik bölgeye dikkat ediniz. CAM kinazlar, MAPK ve mTOR yolaklarının yukarı yönlü aktivatörleridir ve ayrıca aşağı yönlü MAPK hedeflerini fosforile ederler (45). B, Fosforile edilmiş serini çevreleyen zenginleştirilmiş doğrusal substrat motifleri Fisher exact testi kullanılarak değerlendirilmiştir. X ekseni Benjamin-Hochberg FDR değerlerini temsil etmektedir. Önceki sonuçlarla uyumlu olarak, sinyal iletimi ve hücre döngüsü düzenlemesinde yer alan MAPK ve diğer kinazların substratları olan bölgelere karşılık gelen 24 doğrusal motif önemli ölçüde zenginleşmiştir. ERK1,2 kinaz substrat motiflerinin zenginleşmesine ek olarak, BRAF ve diğer RAF kinazları düzenleyebilen 14-3-3’ün (46) ve BRAF/MAPK ile birlikte hareket ederek temel transkripsiyon faktörlerini düzenleyebilen GSK3’ün (47) bağlanma motifi zenginleşmesine dikkat edin. Hematoksilen karşı boyası (C-F) ile immünoperoksidaz-DAB (3,3′-diaminobenzidin) ile tespit edilen immünoreaktivite ile IHC gerçekleştirilmiştir (pERK Klon 137F5, Cell Signaling Technology). pERK’nin vemurafenib öncesi (C ve D) yukarı regülasyonuna ve vemurafenib-PD’de (F) devam eden vemurafenib-1-ay (E) aşağı regülasyonuna dikkat edin. Bu köpekte stres-JNK ve PI3K/AKT/mTOR yolaklarındaki genlerin PD’de yukarı regülasyonu kaydedilmiştir.

Şekil 5.
Vemurafenib öncesi, vemurafenib 1. ayda ve nüksetme döneminde toplanan köpek InvUC RNA-sekans verilerindeki immün işaretler (bkz. renk anahtarı) ve Şekil 3’teki yöntemler kullanılarak normal köpek mesane mukozası (n ¼ 4) ile karşılaştırma. Isı haritasında soğuk bağışıklık işaretleri yeşil, sıcak bağışıklık işaretleri ise kırmızı renkle gösterilmiştir. Her sütun bir örnekten elde edilen verileri temsil etmektedir ve örnekler zaman noktasına göre gruplandırılmıştır (bkz. anahtar). Vakalar her zaman noktası için aynı sırada listelenmiştir. Bir bağışıklık genleri paneli (n ¼ 1.797; ref. 35) kullanılarak yapılan hiyerarşik kümelemede, bazal tümörler (A), lüminal tümörlere (B) kıyasla doğal olarak daha sıcak bağışıklığa sahip pre-vemurafenib idi. Her iki alt tipte de bağışıklık modelleri vemurafenib-1 ayda daha sıcak ve vemurafenib-PD’de daha soğuk hale gelmiştir. Isı haritaları ayrıca kansere karşı bağışıklık tepkisini (C) artırmada veya bağışıklık tepkisini (D) bastırmada rol oynayan spesifik genleri değerlendirmek için de oluşturulmuştur (3–5, 12–15, 35). Bağışıklık güçlendirici genlerin vemurafenib-1-ay’da artan ve vemurafenib-PD’de azalan ifadesine dikkat edin. Tümörlerdeki belirli immün hücre tiplerinin bolluğunu daha fazla değerlendirmek için toplu RNA-sekans verilerinin (E) CIBERSORT analizleri gerçekleştirilmiştir. Mavinin tonları, öngörülen bağışıklık ortamında o tip hücrelerin tahmini yüzdesini gösterir (anahtara bakın), daha koyu renkler o tip bağışıklık hücresinin daha yüksek yüzdelerini (örneğin, koyu mavi, %20) temsil eder. 1 aylık vemurafenib’de CD8 T hücresi işaretlerindeki artışa ve vemurafenib-PD’de CD8 T hücresi ve tip 1 makrofaj işaretlerindeki azalmaya ve düzenleyici T hücresi işaretlerindeki artışa dikkat edin. Biyopsileri yalnızca bu iki zaman noktasında mevcut olan 25 vaka dahil edildiğinde, vemurafenib öncesi ve 1 aylık vemurafenib dönemlerinde de benzer sonuçlar bulunmuştur.

Bağışıklık skoru 17 köpekte (%68) vemurafenib öncesi ile 1 aylık vemurafenib arasında artmış, 4 köpekte (%16) aynı kalmış ve 4 köpekte (%16) azalmıştır. İmmün skoru artan köpeklerin %53’ünde ve immün skoru sabit kalan veya azalan köpeklerin %25’inde remisyon meydana gelmiştir (OR, 3.38; %95 CI, 0.42-21.73; P = 0.181). 1 aylık vemurafenib tedavisinde daha yüksek bağışıklık skoru daha uzun sağkalımla anlamlı şekilde ilişkiliydi (HR, 0,14; %95 GA, 0,03-0,62; P = 0,0338) ve en belirgin olarak ≤2 ile ≥4 skorları karşılaştırıldığında görüldü. İmmün skoru ≤2 olan 10 köpekte, vemurafenib ile ilişkili ortalama sağkalım 185 gün (aralık, 18-921 gün) ve OS 259 gün (aralık, 19- 1.261 gün) olmuştur. İmmün skoru ≥4 olan 12 köpekte, vemurafenib ile ilişkili ortalama sağkalım 301 gün (aralık, 106-1.252 gün) ve OS 357 gün (aralık, 158-1.272 gün) olmuştur. Vemurafenib- 1 aylık ve vemurafenib-PD arasında, 17 köpeğin 16’sında (%94) bağışıklık skoru azalmış ve bir köpekte (%6) artmıştır; transkriptom değişikliklerinin örnekleri Şekil 5 ve Ek Tablo S2’de verilmiştir.

Bağışıklıkla ilgili genlerdeki örüntüleri belirlemek için, vemurafenibden etkilendiği bildirilenler de dahil olmak üzere kansere karşı bağışıklık yanıtında önemli olan gen listelerinden ısı haritaları oluşturulmuştur (Şekil 5; refs. 2–5, 10–13, 48). 1 aylık vemurafenib tedavisinde bağışıklık sistemini güçlendiren genlerin ekspresyonunda kayda değer bir artış ve vemurafenib-PD tedavisinde bu genlerin ekspresyonunda azalma görülmüştür (Şekil 5; Ek Tablo S2). Vemurafenib-PD’de, vakaların çoğunda (%76) CTLA-4, PD-L1, PD-1 ve B7X dahil olmak üzere bir veya daha fazla immün kontrol noktasında yukarı regülasyon vardı (Ek Tablo S2). CIBER- SORT analizleri (Şekil 5) vakalar arasındaki heterojenliği doğrulamış, ancak vemurafenib-1-ay’da CD8 T hücresi izlerinde artış ve vemurafenib-PD’de CD8 T hücresi ve tip 1 makrofaj izlerinde azalma ve düzenleyici T hücresi izlerinde artış eğilimleri göstermiştir.

Tartışma

Çalışmadan elde edilen önemli bulgular şunlardır: (i) köpeklerde vemurafenib’e verilen yanıtlar, başlangıçta iyi antitümör aktivite ve ardından ilaç direncinin yanı sıra farmakodinamik kutanöz etkiler de dahil olmak üzere insanlarda bildirilenleri taklit etmektedir, (ii) köpeklerde vemurafenib tedavisinin başlarında immün sıcak işaretler ve kanser ilerlemesinde immün soğuk işaretler açısından insanlardakilere paralel immün işaretler ve (iii) yeni güvenlik sinyalleri yoktur (2–5, 10–13, 33). Bu bulgular, köpek modelinin uygunluğunu ve insanlarda BRAF hedefli tedavideki ilerlemeleri sağlamaya yardımcı olmak için doğal olarak oluşan InvUC’ye sahip köpeklerin çalışmalara dahil edilmesini desteklemektedir.

Vemurafenib, InvUC’lu köpeklerde iyi antitümör aktivite göstermiştir. 38 remisyon oranı ve 6 aylık PFI, tüm çalışmalarda remisyonların çoğu PR olan InvUC’lu köpeklerde diğer tek ajan tedavilerinden elde edilen <%25 remisyon oranları ve yaklaşık 4 aylık PFI’lar ile olumlu bir şekilde karşılaştırılmaktadır (17, 23, 28). Bu, ilaç direncinin yaygın olduğu InvUC gibi bir kanserde olumlu bir yanıt olarak kabul edilirken, remisyon oranı, bazı CR’lerin gözlendiği %50 remisyon oranlarının tipik olduğu insan melanom hastalarında bildirilenden daha düşük görünmektedir (1). Köpek InvUC’sinde vemurafenibin etkilerinin, yukarı akış faktörlerinin yanıtı yumuşatarak %10-%30 aralığında daha mütevazı remisyon oranlarına yol açabildiği insan tiroid ve kolon karsinomlarındakilere daha çok benzemesi mümkündür (8, 9). Ayrıca vemurafenib formülasyonunun köpekler için değil insanlar için optimize edildiği de bilinmektedir (49). Farmakokinetik, köpeklerde insanlardan daha fazla değişkenlik göstermiştir (49); bunun nedeni kısmen köpeklerdeki daha kısa vemurafenib yarı ömrü ve tutarsız emilim olabilir.

Köpeklerdeki (örneğin, 2 haftada 20 mg/mL veya 40,8 mmol/L kısmi EAA’dan hesaplanan ortalama plazma kararlı durum konsantrasyonu) vemurafenib konsantrasyonları genellikle köpek InvUC hücrelerini in vitro öldürmek için gerekenlerden daha yüksek olsa da (BRAF mutasyona uğramış hücrelerde IC50 10 mmol/L, BRAF vahşi tip hücrelerde 30 mmol/L; ref. 20), konsantrasyonlar kanserli insan hastalarda hedef vemurafenib plazma konsantrasyonlarının yaklaşık yarısı kadardı (31–39 mg/mL; ref. 49) ve konsantrasyonların sabit hedef inhibisyonu için korunması zordu. Vemurafenib alan köpeklerin %18’inde görülen kutanöz skuamöz hücreli karsinom ve skuamöz papillom gibi yeni deri lezyonları özellikle ilgi çekiciydi çünkü bunlar vemurafenibin insanların %10-30’unda görülen yönetilebilir farmakodinamik etkileri olarak kabul edilmektedir (43). Bunlar, altta yatan RAS mutasyonlarına sahip hücrelerdeki paradoksal yolak aktivasyonuna bağlanmaktadır (43). Köpeklerdeki bulgular, etkili hedef etkileşimini ve bu paradoksal yolak aktivasyonunun köpeklerde ve insanlarda benzer bir sıklıkta olduğunu desteklemektedir (43). ALT yüksekliği köpeklerde insanlara göre daha sık görülmüştür (25), ancak karaciğer fonksiyon bozukluğu tespit edilmemiştir.

RNA-sekans bağışıklık örüntüleri en ilginç bulgulardan biriydi. Bu örüntüler, MAPK yolağı genlerinin ve diğer sinyal genlerinin ekspresyonundan bağımsız olarak mevcuttu. Daha da önemlisi, 1 aylık vemurafenib döneminde köpeklerin üçte ikisinde bağışıklık skoru artmış, yani daha bağışık hale gelmiştir. Kanser ilerledikçe, köpeklerin %94’ünde bağışıklık skoru azalmış, yani bağışıklık sistemi daha soğuk hale gelmiştir. Bu bulgular, BRAF inhibitörleri ile tedavi edilen insanlardan alınan tümör dokuları üzerinde yapılan çalışmalarla ve köpek InvUC modeline daha fazla geçerlilik kazandıran deneysel hayvan çalışmalarıyla korelasyon göstermektedir (2–5, 10–14, 33). Bağışıklık durumunun çeşitli kanser tedavilerine verilen yanıt ve insanlardaki sonuçlar üzerinde derin etkileri olduğu düşünüldüğünden daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir (35, 36, 48). Genel olarak, immün soğuk tümörler tipik olarak daha az yanıt verirken, immün sıcak tümörler kanser ilaçlarına, özellikle de immünoterapilere daha fazla yanıt vermektedir (35, 48). İmmün işaretleri güçlendiren ve diğer kanser tedavilerinin etkinliğini artırabilecek ilaçların belirlenmesine yönelik ilgi oldukça yüksektir.

Vemurafenibin immün imzaları güçlendirebileceği birkaç olası mekanizma vardır. Genel düzeyde, immünoterapi, kemoterapi ve radyasyonun antikanser etkilerinin en azından kısmen neoantijenlerin ve hasarla ilişkili moleküler proteinlerin ölmekte olan kanser hücrelerinden salınmasına bağlı olduğuna ve daha sonra kansere karşı bir bağışıklık saldırısını tetiklediğine veya artırdığına dair kanıtlar artmaktadır (48). Melanomda, mutasyona uğramış BRAF tarafından yönlendirilen sinyal aktivitesi, tümörle ilişkili antijenlerin ekspresyonunun azalmasıyla ilişkilendirilmiştir ve BRAF inhibitör tedavisi, tümör antijenlerinin ve MHC’nin ekspresyonunun artmasına, CD8+ TIL’lerin artmasına, immünosupresif sitokinler IL6 ve IL8’in azalmasına ve T-hücresi sitotoksisitesinin belirteçlerinin artmasına neden olmuştur (2–5, 11, 13, 14, 33). Apoptotik hücre ölümüne ek olarak, BRAF inhibitörleri ile tedavi edilen melanom hücreleri, gözeneklerin dendritik hücreleri aktive eden inflamatuar sitokinleri saldığı piroptozise uğrayabilir (4). İlginç bir şekilde, BRAF inhibitörü tedavisi ile antijen ekspresyonu ve TIL’ler arttıkça, TIM-3 ve PD1 gibi T-hücre tükenme belirteçlerinde de artış meydana gelir, bu da gelişmiş immün etkiler için en uygun aralığın daha fazla aydınlatılması gerektiğini gösterir (2). BRAF hedefli tedavide melanom progresyonunda antijen ekspresyonunda azalma, TIL’lerde azalma ve tümörle ilişkili makrofajlarda artış gözlenmiştir (2, 3, 11, 13, 33). Çalışmadaki köpeklerin tümörlerinde de benzer değişiklikler gözlenmiştir. Bu durum, kombinasyon immünoterapi-BRAF inhibitörü tedavilerinin optimize edilmesine ve doğrulanmasına potansiyel olarak yardımcı olacak köpek çalışmalarının dahil edilmesi için destek sağlamaktadır.

İnsanlarda bildirilen vemurafenib yanıtı ve direnç mekanizmalarında beklenen öneme sahip yolaklardaki değişiklikler için RNA-sekans verileri analiz edildiğinde (2, 3, 5, 10, 11), tüm köpeklerde vemurafenib-PD’de bu genlerde veya yolaklarda bir veya daha fazla değişiklik olduğu görülmüştür. Bununla birlikte, vakaların çoğunda remisyona veya kısa ve uzun PFI’ye neden olan belirli bir tutarlı değişiklik gözlenmemiştir. BRAFV600E, esas olarak klasik MAPK yolu aracılığıyla MAPK yolunun yapısal aktivasyonuna neden olur. Bu yol bloke edildiğinde, stres JNK, PI3K/AKT/mTOR ve diğer alternatif yollar önemli hale gelir. Her üç yol da ortak nükleer hedefler üzerinde birleşir. Beklendiği gibi, klasik MAPK yolağındaki bir veya daha fazla gen, vemurafenib öncesi köpeklerin çoğunda aşırı eksprese edilmiştir. Benzer şekilde, BRAF’ın downstream’i olan ve MAPK yolağı aktivitesinin bir göstergesi olan ERK, vemurafenib öncesi vakaların %84’ünde yukarı regüle edilmiştir.

Beklendiği gibi, ERK ekspresyonu 1 aylık vemurafenib tedavisinde vakaların %91’inde azalmıştır. ERK ekspresyonu vemurafenib-PD’de vakaların %59’unda tekrar artmış ve direnç geliştikçe MAPK yolağıyla ilişkili sinyalizasyonun geri kazanılmasıyla tutarlı olmuştur. Fosforlanmış BRAF ve ilgili MAPK proteinlerinin 1 aylık vemurafenib ile azalması ve kanser ilerlemesinde artmış ekspresyonuna ilişkin fosfoproteomik sonuçlar gibi pERK IHC sonuçları da bu bulgularla tutarlıdır. Bununla birlikte, sonuçların yorumlanmasında birçok karmaşıklık söz konusudur. MAPK yolağındaki çoğu genin yukarı regülasyonu gözlenmemiştir, bu da alternatif sinyal yolaklarına birden fazla giriş ve çıkış noktası olduğunu ve diğer çalışmalarda da öne sürülen karmaşık yolak regülasyonunu düşündürmektedir (50). Benzer şekilde, fosfoproteomik sonuçlar vemurafenibin MAPK yolaklarında çeşitli düzenleyici değişikliklere neden olduğunu ve yolaklar arasında karmaşık etkileşimler olduğunu göstermektedir.

Klasik MAPK, stres-JNK ve PI3K/AKT/mTOR yolaklarındaki çeşitli genlerin ve kanser ilerlemesinde fosforile proteinlerin ekspresyonundaki artışa ek olarak, köpek dokularında insanlarda vemurafenib direnci ile ilişkilendirilen ek transkriptomik değişiklikler bulunmuştur. Bunlar arasında PTEN ve NF1’in kaybı ve CCND1, PDGFRB, EGFR, AXL ve EphA2’nin artmış ekspresyonu yer almaktadır (2, 3, 5, 10, 13, 44). Daha önce vemurafenib etkileriyle bağlantılı olmayan diğer genler ve süreçler de tanımlanmıştır (Ek Tablo S1); bunlar arasında membran kanalları, taşıyıcı aktivitesi, diğer sinyalizasyon ve hücre metabolizması ve enerjisini içeren genlerin yukarı regülasyonu yer almaktadır. Vemurafenib, birçok ilaç gibi, geniş bir etki yelpazesine sahip olabilir.

İnsan mesane kanserinde moleküler alt tiplerin rolüne ilişkin kanıtlar artmaktadır (19, 34) ve bu nedenle köpeklerde moleküler alt tip ve bağışıklık durumu arasındaki ilgi çekici bağlantı daha fazla çalışma gerektirmektedir. İnsanlarda, bazal alt tip mesane kanseri bağışıklık açısından daha sıcak bir durumla, luminal tümörler ise bu çalışmadaki köpeklerde de görüldüğü gibi daha soğuk denilebilecek bir bağışıklık ile ilişkilendirilmektedir (19, 34). Diğer türler arası benzerliklerde, erkek köpekler, InvUC’lu erkeklerde olduğu gibi bazal tümör grubunda daha az yer almıştır (19, 34). İnsanlardaki bazal alt tipin daha agresif kanser davranışına paralel olarak (19, 34), köpeklerdeki bazal alt tip, özellikle ilerlemede daha kısa PFI ve ölümde daha yüksek uzak metastaz oranı ile ilişkilendirilmiştir. BRAF mutasyonlarının insan InvUC’sinde yaygın olmamasına rağmen, farklı mutasyonel olayların benzer moleküler alt tiplere dönüşebilmesi ilginçtir (18, 19, 34).

Köpeklerdeki sinyal ve bağışıklık yollarındaki heterojenlik olumlu bir bulgu olarak görülmekte ve köpek modelinin insan durumuyla ilgisi ve çok karmaşık olan bu hastalıkta kanser tedavisini kişiselleştirmeye yönelik çalışmalar açısından güçlü bir yönü olarak değerlendirilmektedir. Köpek modeli, mekanizma çalışmaları için kontrollü ve daha homojen bir ortam sunması açısından önemli olan diğer preklinik modelleri tamamlayabilir. Çoklu onkojenik ve immünolojik mekanizmaları ele alma olasılığı daha yüksek olan kombinasyon terapisi yaklaşımlarını test etmek için köpek çalışmaları yapılabilir. Ayrıca, “büyük veri bilimi” alanı gelişmeye devam ettikçe, NCI’ın Integrated Canine Data Commons’ında depolanan köpek deney verileri, özellikle birçok karmaşık veri türünü entegre ederken ve türler arası analizler gerçekleştirirken daha fazla veri analiz yöntemi ve uygulaması için bir kaynak sunmaktadır.

Sonuç olarak, bu çalışma köpeklerde ve insanlarda BRAF hedefli tedavinin sonuçlarında birçok benzerlik olduğunu göstermektedir. Bu, köpek modelinin uygunluğunu ve BRAFV595E mutasyonunu taşıyan doğal olarak oluşan InvUC’un, insanlarda BRAF hedefli tedavi yaklaşımları ve kombinasyon tedavileri hakkında bilgi vermeye yardımcı olmak için daha fazla değerlendirilmesini ve uygulanmasını desteklemektedir. Türler arası kombinasyon terapisi çalışmaları için insanlardakine benzer köpek büyük molekül terapilerinin geliştirilmesi kritik önem taşımaktadır. Bu kolektif çalışma, veteriner onkoloji ortamında da faydalı olacak ve translasyonel araştırmalar için değerli olacaktır.

Yazarların Beyanı

P. Rossman, Puppy Up Foundation’dan hibe ve çalışmanın yürütülmesi sırasında Genentech, Inc. şirketinden diğer destekleri beyan etmektedir. D. Tuerck, sunulan çalışma dışında Genentech olarak da bilinen Amerika Birleşik Devletleri’ndeki F. Hoffmann La-Roche AG, Basel, İsviçre’den diğer destekleri ve Basel, İsviçre’deki F. Hoffmann La-Roche’nin (Zelboraf, INN: vemurafenib üreticisi) bir çalışanı olduğunu beyan etmektedir. D. Tuerck, işvereninin sınırlı miktarda oy hakkı olmayan hissesine sahiptir. R. Mohallem çalışmanın yürütülmesi sırasında Genentech’ten başka destekler ve Puppy Up Foundation’dan hibeler aldığını beyan etmiştir. M. Merchant, sunulan çalışma dışında Genentech/Roche’den şahsi olarak ücret aldığını beyan etmiştir. C.M. Fulkerson, Puppy Up Foundation’dan hibeler ve çalışmanın yürütülmesi sırasında Genentech’ten finansal olmayan destek beyan etmiştir. E. Murray, çalışmanın yürütülmesi sırasında Genentech, Inc. şirketinden diğer destekleri; sunulan çalışma dışında Genentech, Inc. şirketinden diğer destekleri beyan etmiştir. N. Dybdal, sunulan çalışma dışında Genentech, Inc. tarafından sağlanan diğer destekleri beyan etmektedir. L.M. Fourez, çalışmanın yürütülmesi sırasında Genentech’ten diğer destekleri beyan etmektedir. D.W. Knapp, Genentech ve Scottish Terrier Club of America’dan diğer destekleri ve çalışmanın yürütülmesi sırasında Puppy Up Foundation ve NCI’dan hibeleri beyan etmiştir. Diğer yazarlar tarafından herhangi bir beyan yapılmamıştır.

Katkıda bulunan yazarlar

P. Rossman: Kavramsallaştırma, veri küratörlüğü, resmi analiz, araştırma, yazım-orijinal taslak, yazım-inceleme ve düzenleme. T.S. Zabka: Kavramsallaştırma, kaynaklar, denetim, fon temini, araştırma, metodoloji, yazım-orijinal taslak, proje yönetimi, yazım-inceleme ve düzenleme. A. Ruple: Veri küratörlüğü, yazılım, resmi analiz, doğrulama, araştırma, metodoloji, yazım- orijinal taslak, yazım-inceleme ve düzenleme. D. Tuerck: Veri küratörlüğü, resmi analiz, doğrulama, araştırma, görselleştirme, metodoloji, yazma-orijinal taslak, yazma-inceleme ve düzenleme. J.A. Ramos-Vara: Veri düzenleme, resmi analiz, doğrulama, araştırma, görselleştirme, metodoloji, yazma-inceleme ve düzenleme. L. Liu: Veri küratörlüğü, resmi analiz, araştırma, metodoloji, yazım-inceleme ve düzenleme. R. Mohallem: Kaynaklar, veri küratörlüğü, yazılım, biçimsel analiz, araştırma, görselleştirme, metodoloji, yazma-orijinal taslak, yazma-inceleme ve düzenleme. M. Merchant: Kaynaklar, veri küratörlüğü, araştırma, metodoloji, yazma-inceleme ve düzenleme. J. Franco: Veri küratörlüğü, yazılım, resmi analiz, doğrulama, araştırma, metodoloji, yazma-inceleme ve düzenleme. C.M. Fulkerson: Kavramsallaştırma, veri oluşturma, araştırma, yazma-inceleme ve düzenleme. K.P. Bhide: Kavramsallaştırma, kaynaklar, yazılım, resmi analiz, araştırma, metodoloji, yazma-inceleme ve düzenleme. M. Breen: Veri küratörlüğü, yazılım, biçimsel analiz, doğrulama, araştırma. U.K. Aryal: Kavramsallaştırma, kaynaklar, veri küratörlüğü, yazılım, resmi analiz, gözetim, fon sağlama, doğrulama, araştırma, görselleştirme, metodoloji, proje yönetimi, yazma-inceleme ve düzenleme. E. Murray: Araştırma, yazma-inceleme ve düzenleme. N. Dybdal: Kavramsallaştırma, kaynaklar, veri küratörlüğü, yazılım, resmi analiz, denetim, doğrulama, araştırma, görselleştirme, metodoloji, yazma-orijinal taslak, proje yönetimi, yazma-inceleme ve düzenleme. S.M. Utturkar: Kavramsallaştırma, kaynaklar, veri küratörlüğü, yazılım, resmi analiz, gözetim, finansman temini, doğrulama, araştırma, görselleştirme, metodoloji, yazma-orijinal taslak, proje yönetimi, yazma-inceleme ve düzenleme. L.M. Fourez: Veri küratörlüğü, yazılım, resmi analiz, araştırma, görselleştirme, metodoloji, yazma-orijinal taslak, proje yönetimi, yazma-inceleme ve düzenleme. A.W. Enstrom: Veri küratörlüğü, yazılım, biçimsel analiz, araştırma, metodoloji, yazma-inceleme ve düzenleme. D. Dhawan: Kavramsallaştırma, veri küratörlüğü, yazılım, resmi analiz, denetim, doğrulama, araştırma, görselleştirme, metodoloji, yazma-orijinal taslak, proje yönetimi, yazma-inceleme ve düzenleme. D.W. Knapp: Kavramsallaştırma, kaynaklar, veri küratörlüğü, yazılım, resmi analiz, gözetim, finansman temini, doğrulama, araştırma, görselleştirme, metodoloji, yazım-orijinal taslak, proje yönetimi, yazım-inceleme ve düzenleme.

Teşekkürler

Yazarlar, Purdue Karşılaştırmalı Onkoloji Programı’nın kendini işine adamış klinisyenlerine ve personeline bu projedeki çalışmaları için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca, küresel Roche vemurafenib ekibinden Dawn Colburn ve Tony Contreras’ın klinik sınıf ilacın piyasaya sürülmesine verdikleri destek için; Lesley Cunningham farmakokinetik analizi mümkün kıldığı için önceki bir DMPK Genentech bilim insanı; Genentech Safety Assessment’ten Aaron Fullerton mRNA gönderimini ve analizini mümkün kıldığı için; Genentech araştırmasından John Moffat hücre hattı biyolojisi konusundaki ilk girdileri için; Genentech sözleşmeler ekibinden Rochelle Pando işbirliğimizin çerçevesini oluşturduğu için; ve Roche’tan Silvia Kimpfler klinik ilacın sevkiyatını organize ettiği için. Ayrıca köpek sahiplerine, köpeklerinin çalışmaya katılmasına izin verdikleri ve çalışmayı destekledikleri için içten teşekkürlerimizi sunarız. Fosfoproteom analizi için tüm LC/MS-MS verileri Purdue Proteomik Merkezi, Bindley Biyobilim Merkezi, Purdue Üniversitesi’nde toplanmıştır.
Bu çalışma kısmen Puppy Up Foundation ve F. Hoffmann-La Roche AG tarafından desteklenmiştir.

Bu makalenin yayın masrafları kısmen sayfa ücretlerinin ödenmesi ile karşılanmıştır. Bu nedenle, bu makale 18 U.S.C. Bölüm 1734 uyarınca yalnızca bu gerçeği belirtmek için reklam olarak işaretlenmelidir.

16 Ekim 2020’de teslim alındı; 6 Nisan 2021’de revize edildi; 19 Ağustos 2021’de kabul edildi; ilk olarak 25 Ağustos 2021’de yayınlandı.

1.

Holderfield M, Deuker M, McCormick F, McMahon M. Targeting RAF kinases for cancer therapy: B-RAF-mutated melanoma and beyond. Nat Rev Cancer 2014;14:455–67.

2.

Frederick DT, Piris A, Cogdill AP, Cooper ZA, Lezcano C, Ferrone CR, et al. BRAF inhibition is associated with enhanced melanoma antigen expression and a more favorable tumor microenvironment in patients with metastatic melanoma. Clin Cancer Res 2013;19:1225–31.

3.

Luke JJ, Flaherty KT, Ribas A, Long GV. Targeted agents and immunotherapies: optimizing outcomes in melanoma. Nat Rev Clin Oncol 2017; 14:463–82.

4.

Erkes DA, Cai W, Sanchez IM, Purwin TJ, Rogers C, Field CO, et al. Mutant BRAF and MEK inhibitors regulate the tumor immune microenvironment via pyroptosis. Cancer Discov 2020;10:254–69.

5.

Patel H, YacoubN,Mishra R, White A, Long Y, Alanazi S, et al. Current advances in the treatment of BRAF-mutant melanoma. Cancers 2020;12:482.

6.

Maurer A, Ortiz-Bruechle N, Guricova K, Rose M, Morsch R, Garczyk S, et al. Comparative genomic profiling of glandular bladder tumours. Virchows Arch 2020;477:445–54.

7.

Zaravinos A, Chatziioannou M, Lambrou GI, Boulalas I, Delakas D, Spandidos DA. Implication of RAF and RKIP genes in urinary bladder cancer. PatholOncol Res 2011;17:181–90.

8.

Al-Jundi M, Thakur S, Gubbi S, Klubo-Gwiezdzinska J. Novel targeted therapies for metastatic thyroid cancer-a comprehensive review. Cancers 2020;12:2104.

9.

Huynh JC, Schwab E, Ji J, Kim E, Joseph A, Hendifar A, et al. Recent advances in targeted therapies for advanced gastrointestinal malignancies. Cancers 2020;12: 1168.

10.

Kuske M, Westphal D, Wehner R, Schmitz M, Beissert S, Praetorius C, et al. Immunomodulatory effects of BRAF and MEK inhibitors: implications for melanoma therapy. Pharmacol Res 2018;136:151–9.

11.

Song C, Piva M, Sun L, Hong A, Moriceau G, Kong X, et al. Recurrent tumor cellintrinsic and -extrinsic alterations duringMAPKi-induced melanoma regression and early adaptation. Cancer Discov 2017;7:1248–65.

12.

Hugo W, Shi H, Sun L, Piva M, Song C, Kong X, et al. Non-genomic and immune evolution of melanoma acquiring MAPKi resistance. Cell 2015;162: 1271–85.

13.

Tian Y, Guo W. A review of the molecular pathways involved in resistance to BRAF inhibitors in patients with advanced-stage melanoma. Med Sci Monit 2020;26:e920957.

14.

Long JE, Wongchenko MJ, Nickles D, Chung WJ, Wang BE, Riegler J, et al. Therapeutic resistance and susceptibility is shaped by cooperative multicompartment tumor adaptation. Cell Death Differ 2019;26:2416–29.

15.

Gunda V, Gigliotti B, Ndishabandi D, Ashry T, McCarthy M, Zhou Z, et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. Br J Cancer 2018;119: 1223–32.

16.

Mak IWY, Evaniew N, Ghert M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. Am J Transl Res 2014;6:114–8.

17.

Knapp DW, Dhawan D, Ramos-Vara JA, Ratliff TL, Cresswell GM, Utturkar S, et al. Naturally-occurring invasive urothelial carcinoma in dogs, a unique model to drive advances in managing muscle invasive bladder cancer in humans. Front Oncol 2020;9:1493.

18.

Dhawan D, Hahn NM, Ramos-Vara JA, Knapp DW. Naturally-occurring canine invasive urothelial carcinoma harbors luminal and basal transcriptional subtypes found in human muscle invasive bladder cancer. PLoS Genet 2018;14:e1007571.
19.

Robertson AG, Kim J, Al-Ahmadie H, Bellmunt J, Guo G, Cherniack AD, et al. Comprehensive molecular characterization of muscle-invasive bladder cancer. Cell 2018;174:1033.

20.

Decker B, Parker HG, Dhawan D, Kwon EM, Karlins E, Davis BW, et al. Homologous mutation to human BRAF V600E is common in naturally occurring canine bladder cancer–evidence for a relevant model system and urinebased diagnostic test. Mol Cancer Res 2015;13:993–1002.

21.

Mochizuki H, Shapiro SG, Breen M. Detection of BRAF mutation in urine DNA as a molecular diagnostic for canine urothelial and prostatic carcinoma. PLoS One 2015;10:e0144170.

22.

Cronise KE, Hernandez BG, Gustafson DL, Duval DL. Identifying the ErbB/ MAPK signaling cascade as a therapeutic target in canine bladder cancer. Mol Pharmacol 2019;96:36–46.

23.

Knapp DW, Ruple-Czerniak A, Ramos-Vara JA, Naughton JF, Fulkerson CM, Honkisz SI. A nonselective cyclooxygenase inhibitor enhances the activity of vinblastine in a naturally-occurring canine model of invasive urothelial carcinoma.
Bladder Cancer 2016;2:241–50.

24.

Veterinary Cooperative Oncology Group – common terminology criteria for adverse events (VCOG-CTCAE) following chemotherapy or biological antineoplastic therapy in dogs and cats v1.1. Vet Comp Oncol 2016;14: 417–46.

25.

Maio M, Lewis K, Demidov L, Mandala M, Bondarenko I, Ascierto PA, et al. Adjuvant vemurafenib in resected, BRAF(V600) mutation-positive melanoma (BRIM8): a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre, phase 3 trial. Lancet Oncol 2018;19:510–20.

26.

Childress MO, Adams LG, Ramos-Vara JA, Freeman LJ, He S, Constable PD, et al. Results of biopsy via transurethral cystoscopy and cystotomy for diagnosis of transitional cell carcinoma of the urinary bladder and urethra in dogs: 92 cases (2003–2008). J Am Vet Med Assoc 2011;239:350–6.

27.

Honkisz SI, Naughton JF, Weng HY, Fourez LM, Knapp DW. Evaluation of two-dimensional ultrasonography and computed tomography in the mapping and measuring of canine urinary bladder tumors. Vet J 2018;232: 23–6.

28.

Dhawan D, Ramos-Vara JA, Naughton JF, Cheng L, Low PS, Rothenbuhler R, et al. Targeting folate receptors to treat invasive urinary bladder cancer. Cancer Res 2013;73:875–84.

29.

Eisenhauer EA, Therasse P, Bogaerts J, Schwartz LH, Sargent D, Ford R, et al. New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). Eur J Cancer 2009;45:228–47.

30.

Sparidans RW, Durmus S, Schinkel AH, Schellens JH, Beijnen JH. Liquid chromatography-tandem mass spectrometric assay for the mutated BRAF inhibitor vemurafenib in human and mouse plasma. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2012;889–90:144–7.

31.

Friedman LM, Furburg CD, DeMets DL, editors. Fundamentals of clinical trials. 3rd ed. Mosby, St Louis; 1996.

32.

Nahm KY, Heo JS, Lee JH, Lee DY, Chung KR, Ahn HW, et al. Gene profiling of bone around orthodontic mini-implants by RNA-sequencing analysis. Biomed Res Int 2015;2015:538080.

33.

Wilmott JS, Long GV, Howle JR, Haydu LE, Sharma RN, Thompson JF, et al. Selective BRAF inhibitors induce marked T-cell infiltration into human metastatic melanoma. Clin Cancer Res 2012;18:1386–94.

34.

McConkey DJ, Choi W. Molecular subtypes of bladder cancer. Curr Oncol Rep 2018;20:77.

35.

Sweis RF, Spranger S, Bao R, Paner GP, Stadler WM, Steinberg G, et al. Molecular drivers of the non-T-cell-inflamed tumor microenvironment in urothelial bladder cancer. Cancer Immunol Res 2016;4: 563–8.

36.

Chen B, Khodadoust MS, Liu CL, Newman AM, Alizadeh AA. Profiling tumor infiltrating immune cells with CIBERSORT. Methods Mol Biol 2018; 1711:243–59.

37.

Mohallem R, Aryal UK. Regulators of TNF-a mediated insulin resistance elucidated by quantitative proteomics. Sci Rep 2020;10:20878.

38.

Cox J, Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol 2008;26:1367–72.

39.

Tynova S, Temu T, Sinitcyn P, Carlson A, Hein MY, Geiger T, et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods 2016;13:731–40.

40.

Webster JD, Miller MA, DuSold D, Ramos-Vara JA. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. J Histochem Cytochem 2009;57:753–61.

41.

Wang G, Wu M, Durham AC, Radaelli E, Mason NJ, Xu X, et al. Molecular subtypes in canine hemangiosarcoma reveal similarities with human angiosarcoma. PLoS One 2020;15:e0229728.

42.

Cheng L, MacLennan GT, Lopez-Beltran A. Histologic grading of urothelial carcinoma: a reappraisal. Hum Pathol 2012;43:2097–108.

43.

Lacouture M, Sibaud V. Toxic side effects of targeted therapies and immunotherapies affecting the skin, oral mucosa, hair, and nails. Am J Clin Dermatol 2018;19:31–9.

44.

Miao B, Ji Z, Tan L, Taylor M, Zhang J, Choi HG, et al. EPHA2 is a mediator of vemurafenib resistance and a novel therapeutic target in melanoma. Cancer Discov 2015;5:274–87.

45.

Chen S, Xu Y, Xu B, Guo M, Zhang Z, Liu L, et al. CaMKII is involved in cadmium activation of MAPK and mTOR pathways leading to neuronal cell death. J Neurochem 2011;119:1108–18.

46.

Obsilova V, Obsil T. The 14–3-3 proteins as important allosteric regulators of protein kinases. Int J Mol Sci 2020;21:8824.

47.

Ngeow KC, Friedrichsen HJ, Li L, Zeng Z, Andrews S, Volpon L, et al. BRAF/ MAPK and GSK3 signaling converges to controlMITF nuclear export. Proc Natl Acad Sci U S A 2018;115:E8668–77.

48.

Galluzzi L, Zitvogel L, Kroemer G. Immunological mechanisms underneath the efficacy of cancer therapy. Cancer Immunol Res 2016;4:895–902.

49.

Zhang W, Heinzmann D, Grippo JF. Clinical pharmacokinetics of vemurafenib. Clin Pharmacokinet 2017;56:1033–43.

50.

Simpson CM, Ferrari N, Calvo F, Bakal C. The dynamics of ERK signaling in melanoma, and the response to BRAF or MEK inhibition, are cell cycle dependent. bioRxiv 2018.