¹Kanser Biyolojisi ve Genetiği Laboratuvarı, Kanser Araştırma Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda, MD, Amerika Birleşik Devletleri, ²Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Ulusal Kanser Araştırma Laboratuvarı, Frederick, MD, Amerika Birleşik Devletleri, ³Klinik Farmakoloji Programı, Kanser Araştırma Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda, MD, Amerika Birleşik Devletleri, ⁴Patoloji Laboratuvarı, Kanser Araştırma Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda, MD, Amerika Birleşik Devletleri, ⁵Genitoüriner Maligniteler Şubesi, Kanser Araştırma Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda, MD, Birleşik Devletler

kinaz inhibisyonu, kombinasyon tedavisi, karşılaştırmalı onkoloji, translasyonel araştırma, ilaç-ilaç etkileşimi, melanom, veterinerlik, ilaç güvenliği

EDİTLEYEN
Mohamed Elbadawy, Benha Üniversitesi, Mısır

DEĞERLENDİREN
Hector Sumano, Universidad Nacional Autónoma de México, Meksika

Lilia Gutierrez, Universidad Nacional Autónoma de México, Meksika

*İLGİLİ YAZAR
Mark Simpson ms43b@nih.gov

UZMANLIK BÖLÜMÜ
Bu makale Frontiers in Veterinary Science dergisinin bir bölümü olan Veteriner Farmakoloji ve Toksikoloji’ye gönderilmiştir

SUNUM: 28 Eylül 2022
KABUL: 10 Kasım 2022
YAYIN: 14 Aralık 2022

Makaleye atıfta bulunmak için
Wei B-R, Peer CJ, Richardson WJ, Hewitt SM, Figg WD and Simpson RM (2022) Pharmacokinetics and tolerability of the dual TORC1/2 inhibitor sapanisertib in combination with the MEK inhibitor trametinib in dogs. Front. Vet. Sci. 9:1056408.
doi: 10.3389/fvets.2022.1056408

TELİF HAKKI © 2022 Wei, Peer, Richardson, Hewitt, Figg ve Simpson. Bu makale Creative Commons Attribution License (CC BY) koşulları altında dağıtılan açık erişimli bir makaledir. Orijinal yazar(lar)a ve telif hakkı sahip(ler)ine atıfta bulunulması ve bu dergideki orijinal yayına atıfta bulunulması koşuluyla, kabul edilmiş akademik uygulamalara uygun olarak diğer forumlarda kullanımına, dağıtımına veya çoğaltılmasına izin verilir. Bu şartlara uymayan hiçbir kullanım, dağıtım veya çoğaltmaya izin verilmez.

Bu makalenin orijinaline şu adresten ulaşılabilir: 10.3389/fvets.2022.1056408

Giriş

Hedefe yönelik küçük moleküllü inhibitör ilaçlar, insan kanser hastalarına benzer şekilde kendiliğinden oluşan doğal kanserli köpekleri tedavi etmek için klasik sitotoksik kemoterapötiklere alternatif ve yardımcı olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır (1-3). Kanserleri daha spesifik bir şekilde hedefleyerek, hasta yanıtı ve güvenlik profilleri optimize edilebilir. Ayrıca, daha geniş spektrumlu kemoterapinin bazı zararlı sonuçlarından kaçınılabilir (4). İnsanlarda ve veteriner hastalarda kanser tedavisi için çeşitli küçük moleküllü ilaçlar onaylanmıştır (örneğin, köpek terapötikleri: toceranib phosphate ve tigilanol tiglate) ve bunlar stabilite, maliyet, hasta uyumu ve farmakokinetik (PK) özellikler açısından belirli avantajlara sahiptir (4, 5). Günümüzdeki küçük moleküllü onkoloji ilaç hedefleri arasında protein kinazlar, DNA hasar onarım enzimleri, proteozomlar ve epigenetik modifikasyonları düzenleyen diğer proteinler yer almaktadır. Ancak bu tür küçük moleküllü inhibitörler sınırsız değildir. Tüm hastalar bu tedavilere yanıt vermemekte ve hastalar ilk yanıttan sonra ilaç direnci kazanabilmektedir (6). En uygun yanıtları elde etmek için çeşitli etki mekanizmaları arasından tedavi seçimine rehberlik etmek üzere kanser hücrelerinin ve doku mikroçevresinin özelliklerine dayalı yeni tedavi stratejileri geliştirilmelidir.

Kritik sinyal yolaklarının onkojenik düzensizliği, hücre büyümesini, farklılaşmasını, metabolizmasını, çoğalmasını, hayatta kalmasını ve hareketliliğini değiştiren anormal protein etkileşim zincirlerine yol açabilir. Kanserdeki kontrolsüz sinyal iletim olayları büyüme faktörleri, sitokinler, hücre-hücre etkileşimleri ve hücre-matriks etkileşiminin yanı sıra gen mutasyonel olayları ile de tetiklenebilir (1). Çeşitli kanserlerde düzensiz hale gelebilen iki temel sinyal iletim yolağı RAS/MAPK (mitojen aktive protein kinaz) ve fosfoinositid 3- kinaz (PI3K)/Akt (protein kinaz B)/mTOR’dur (rapamisinin memeli hedefi). MAPK hiperaktivitesi insan kanserlerinin %85 kadarında görülen bir özelliktir (7), PI3K-Akt yolağı da birçok insan kanserinde sıklıkla anormal şekilde aktive olmaktadır (8). Osteosarkom, mast hücreli tümör, ürotelyal mesane kanseri ve melanom gibi köpek kanserlerinde de bu yolaklar boyunca yüksek hücre sinyali gözlenmiştir (1, 9, 10).

Köpek mukozal melanomunda bu sinyal yolaklarından biri veya her ikisi boyunca birden fazla aracının aşırı aktivasyonu tespit edilmiştir; bu özellik insanlardaki bu nadir melanom alt tipiyle benzerlik göstermektedir (11, 12). Ayrıca, Ras/MAPK ve PI3K/Akt/mTOR yolakları arasında sinyal kaskadı çapraz etkileşimi meydana gelir ve hedefe yönelik monoterapi yaklaşımlarında ilaç direncinin bir mekanizması olarak işlev görebilir (6, 13, 14). Bu nedenle, RAS/MAPK ve PI3K/Akt/mTOR’un birlikte hedeflenmesi hem köpek hem de insan mukozal melanomları için faydalı olabilir (12, 13, 15). Köpek spontan mukozal melanomu insan mukozal melanomundan nispeten daha sık görüldüğünden, köpek hastalarda yürütülen karşılaştırmalı onkoloji araştırmaları translasyonel fayda potansiyeline sahiptir (11, 16).

Köpek mukozal melanom hücre hatları ve preklinik ksenograft modelleri kullanılarak Ras/MAPK ve PI3K/Akt/mTOR sinyal iletim yolaklarına odaklanan bir ilaç taraması sürecinde, küçük moleküllü kinaz inhibitörleri sapanisertib ve trametinib kombinasyon olarak daha ileri seviyede değerlendirilmek üzere seçilmiştir (13). Sapanisertib (PubChem CID 45375953 veya TAK-228), oldukça seçici rekabetçi adenozin trifosfat bağlanması yoluyla hareket eden PI3K/Akt sinyal iletim yolağı içindeki raptor-mTOR (TORC1) ve rictor-mTOR’un (TORC2) (rapamisin kompleksinin memeli hedefi) oral olarak biyoyararlanabilen bir benzoksazol inhibitörüdür (17). Şu anda birden fazla kanser türü için insan onkolojisi klinik çalışmalarına konu olan sapanisertib, köpek melanom hücrelerinde apoptoz ve hücre döngüsü durması ile bağlantılı olarak PI3K downstream mediatörleri S6 ve 4EBP1’i baskılar (13). Trametinib (MEKINIST), aktive edilmiş mitojenle aktive edilen protein/ hücre dışı sinyalle düzenlenen kinaz 1 ve 2’yi (MEK1/2) hedefleyen geri dönüşümlü bir reseptör olmayan tirozin kinaz inhibitörüdür. Trametinib, BRAF (v-raf mürin sarkom viral onkogen homolog B1) V600E veya V600K mutasyonlarını barındıran rezeke edilemeyen veya metastatik melanomlu insan hastaların tedavisi için FDA onaylıdır (18). Trametinib, in vitro ve fare modellerinde köpek melanom hücre hatlarının büyümesini, fosforile edilmiş hücre dışı sinyalle düzenlenen kinazın (ERK) down modülasyonu ile birlikte apoptoz ve hücre döngüsü durması indüksiyonu eşliğinde inhibe eder (13, 19).  

Trametinibin ERK aktivasyonu ve sitoproliferasyon üzerindeki benzer etkileri, köpek mesane kanseri organoidlerinde ve farelerdeki tümör ksenograftlarında da gözlenmiştir (10).

Bu çalışmada, kombine inhibitör tolerabilitesi ve plazma farmakokinetiği, kısa süreli ardışık doz oral uygulama sırasında sağlıklı laboratuvar köpeklerinde tek ajanlara kıyasla incelenmiştir. Bu çalışma, MAPK ve PI3K/Akt hücre sinyal yolaklarından birinin veya her ikisinin yüksek aktiviteleri ile doğal olarak ortaya çıkan köpek kanserlerinin tedavisi ve gelecekte klinik uygulamaya aktarılması için rasyonel bir başlangıç dozu belirlemeye odaklanmıştır. Amaç, mukozal melanomlu köpekler ve nihayetinde insanlar için faydalı tedavi sağlayabilmektir.

Materyal ve Metod
Hayvanlar, deneysel tasarım ve gözlem

Laboratuvar Beagle köpekleri (Charles River Labs, Mattawan, MI), köpek klinik kanser tedavisinde uygulanması önerilen bileşiklerin test edilmesinde denek olarak kullanılmıştır. Hayvanlar en az altı aylıktı ve çalışmanın başlangıcında 6,4-8,8 kg ağırlığındaydı. Rutin veteriner bakımları vardı ve daha önce herhangi bir çalışmada kullanılmamışlardı. Çalışma AAALAC onaylı hayvan bakım merkezlerinde [Charles River Laboratories, Inc., Mattawan, MI; NIH Office of Laboratory Animal Welfare Assurance onayı (https://olaw. nih.gov/assured/app/index.html)], merkezin Etik Kurulu’nun inceleme, izleme ve onayı altında, ABD Halk Sağlığı Servisi’nin laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin ulusal kılavuz ve yönetmeliklerine uygun olarak yürütülmüştür. Çalışma, İyi Laboratuvar Uygulamaları (GLP) düzenleyici kriterlerini kapsayacak şekilde tasarlanmamıştır. Çalışmadaki hayvanlar günlük olarak veya daha sık aralıklarla izlenmiş, vücut ağırlıkları kaydedilmiş ve laboratuvar analizleri için periyodik numuneler alınmıştır. Hematoloji, serum kimyası, koagülasyon, idrar tahlili için klinik patoloji analizleri dahil edilmiş ve farmakokinetik (PK) için kimyasal biyoanaliz gerçekleştirilmiştir (Tablo 1, ardışık doz çalışması) (Charles River Laboratories, Mattawan, MI).

Tekrarlanan doz çalışmaları için 0,1 mg/kg sapanisertib dozunun belirlenmesi, farelerde yapılan önceki çalışmaların ekstrapolasyonuna dayanmaktadır (13, 20), bu sayede bir erkek (M) ve bir dişi (F) köpekte 0,1, 0,5, 0,65 ve 0,8 mg/kg’lık artan bireysel oral dozların, dozlar arasında ≥3 günlük bir ara verme süresi ile ilk değerlendirmesi yapılmıştır. Trametinib için doz seçimi, orijinal ilaç üreticisi (Novartis) tarafından tedavi onayı için düzenleyici kurumlara sağlanan kamuya açık bilgilere dayanmaktadır (21).

Altı erkek ve altı dişi beagle köpek paralel, üç kollu, sabit, tekrarlı oral doz çalışmasına alınmıştır. Grup 1’de, iki erkek (22001, 22002) ve iki dişi (22501, 22502) köpeğe günde tek başına trametinib (0.025 mg/kg) verilmiştir (oral (p.o.), her gün (q.d.)). Grup 2’de, iki erkek (23001, 23002) ve iki dişi (23501, 23502) köpeğe gün aşırı (p.o., gün aşırı (QOD)) tek başına sapanisertib (0.1 mg/kg) verilmiştir. Grup 3’te, iki erkek (24001, 24002) ve iki dişi (24501, 24502) köpeğe 0.025 mg/kg trametinib p.o., q.d. ve 0.1 mg/kg sapanisertib p.o. QOD kombinasyonu verilmiştir. Tüm köpekler tek doz PK örnekleri elde etmek için çalışmanın 1. gününde dozlanmış ve ardından 4-20. günlerde düzenli olarak dozlanmıştır. Köpekler dozlamadan önce gece boyunca aç bırakılmış ve doz uygulamasını takiben 2 saat (saat) boyunca ad libitum beslenmiştir. Tüm hayvanlar, dozlama tamamlandığında 6 gün daha (21-26. günler) gözlemlenmiş ve ardından köpekler tekrar genel hayvan kliniğine (Charles River Laboratories, Mattawan, MI) gönderilmiştir.

PK için plazma numuneleri doz öncesi (-7 gün), ardından her çalışma grubunun ilk dozunu takip eden 1. günden itibaren 1, 2, 4, 8, 24, 48 ve 72. saatlerde toplanmıştır. 6. günde plazma numuneleri doz öncesi, ardından doz sonrası 1, 2, 4, 8 ve 24. saatlerde toplanmıştır. 10. ve 15. günlerde, doz sonrası 2 saatlik bir örnek toplanmıştır. 20. günde plazma numuneleri doz öncesi ve doz sonrası 1, 2, 4, 8, 24, 48 ve 72. saatlerde alınmıştır. Tedavi programı ve klinik patoloji numunesi alma aralıkları Tablo 1’de özetlenmiştir.

Küçük moleküllü inhibitör ilaçlar

İlaçlar kapsül formunda tedarik edilmiştir (Wedgewood 36 ila 46◦F ve Pharmacy, Swedesboro, NJ’yi korumak için nem ve ışıktan uzak tutulmuştur). Her iki ilaç da stabilite aralığında saklanmıştır. Daha yüksek sıcaklıklara kısa süreli maruz kalma (<24 saat) kabul edilebilir olarak değerlendirilir. Eczane, bileşimi ve etki gücünü bağımsız üçüncü taraf analizleriyle doğrulamakta ve ölçülen bileşenlerdeki varyans standardını, genel ABD Farmakopesi tarafından önerilen etki marjlarından (+/- %10) daha sınırlı bir aralık olan +/- %5 olarak belirlemiştir. Her iki ilaç da veteriner hekimlikte kullanım için onaylanmamıştır. Bununla birlikte, trametinib in vitro ve fare modellerinde köpek histiyositik sarkomu ve köpek ürotelyal mesane kanserine karşı umut vaat ettiğini göstermiştir (10, 22). Hücresel sinyal iletim yolağı kaskadları içinde inhibitör hedeflemenin grafik çizimleri gösterilmiştir (Ek Şekil S1).

Trametinib dimetil sülfoksit (trametinib) ve sapanisertib deneyleri

Trametinib ve sapanisertib, ven ponksiyonu ile toplanan köpek plazmasında, K2 etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) (BioIVT, Hicksville, New York) içeren kan tüplerinde ölçülmüş, santrifüj ile ayrılmış ve Charles River Labs (Mattawan, MI) laboratuvarlarında analiz edilene kadar -80◦C’de dondurulmuş şekilde saklanmıştır. Her bir ilaç analiti 8 köpekten alınan toplam 192 örnekte ölçülmüştür. Benzer polariteye sahip olan ve kromatografi ile etkileşime girmeyen propranolol hidroklorür, her bağımsız test için bir iç standart işlevi görmüştür.

Kompartımansız farmakokinetik analizler

PK analizi için FDA 21CFR Bölüm 11 yönetmeliklerine göre onaylanmış Phoenix WinNonlin v8.3 (Certara Corp, Cary, NC) kullanılarak kompartmansız yöntem kullanılmıştır. Maksimum plazma konsantrasyonu (CMAX) ve maksimum plazma konsantrasyonu zamanı (TMAX) gözlenen değerler olarak kaydedilmiştir. Sıfır zamanından son ölçülebilir numune zamanına (AUClast) kadar olan konsantrasyon-zaman eğrisi (AUC) altındaki alan doğrusal yukarı/log-aşağı trapezoidal yöntem [model tipi Plazma (200-202)] kullanılarak hesaplanmıştır. AUCINF (sıfırdan sonsuza kadar olan AUC), CLAST (son ölçülebilir ilaç konsantrasyonu) terminal fazın hız sabiti olan λZ’ye bölünerek ekstrapolasyon yoluyla hesaplanmıştır. Bu sabit, tahmin prosedürü olarak düzgün ağırlıklı en küçük kareler ve (i) düzeltilmiş r2 > 0,8, (ii) terminal fazda TMAX’tan sonra meydana gelen > 3 zaman noktasını içeren kabul kriterleri kullanılarak konsantrasyon-zaman eğrisinin terminal fazının eğiminden belirlenmiştir.

Terminal faz sırasında görünen oral dağılım hacmini (Vz/F) ve mutlak dozun AUCINF’ye bölünmesiyle hesaplanan görünen oral sistemik klerensi (CL/F) içerecek şekilde belirli ilk doz PK parametrelerini tahmin ettik. Ekstrapole edilen AUCINF miktarı >%25’i aşarsa, bu denekler için klerens tahminleri işaretlenmiş ve istatistiksel özetlerden çıkarılmıştır. Bu çalışmada intravenöz dozlama yapılmadığı için biyoyararlanım (F) değerlendirilmediğinden bu, tahmini klerens ve hacmin CL/F ve V/F olarak raporlanması için kabul edilebilir bir standart isimlendirme işlevi görmüştür. Kararlı durum dozlaması için, AUCTAU (kararlı durum dozlama aralığı sırasında) ve kararlı durumdaki görünür oral klerens (CLssF; doz/AUCTAU olarak hesaplanmıştır) kullanılmıştır. Birikim indeksi (AI), ilk dozu takiben kararlı durumdaki AUCTAU’nun AUCLAST’a (o doz aralığı boyunca) bölünmesiyle hesaplanmıştır.

İstatistiksel analizler ve PK özellikleri

Log-normal dağılımlı bu PK verileri için tüm özet istatistikler aritmetik ortalama, medyan, standart sapma, %CV ve geometrik ortalama (GM) şeklinde sunulmuştur. Bir ilaç etkileşiminin kapsamını değerlendirmek amacıyla, seçilen PK parametreleri (CMAX, AUC) için, kombinasyon tedavi grubundaki her bir maruziyet metriğindeki tek ajan gruplarına göre farklılıklardan %90 güven aralığı (CI) ile birlikte bir geometrik ortalama oran (GMR) oluşturulmuştur. Eğer bu %90 güven aralığı varsayılan etkisizlik sınırları olan 0,8-1,25 eşiğini aşarsa, bu durum söz konusu parametrede klinik olarak anlamlı bir değişiklik, yani bir ilaç-ilaç etkileşimi olabileceği şeklinde yorumlanmıştır. Tedavi grupları içinde CMAX ve AUC’nin cinsiyetler arası karşılaştırmaları ve tek ajan ve kombinasyon grupları arasında bir analit için parametrik olmayan iki örnek T-testi (Mann-Whitney, alfa = 0.05;) (GraphPad Prism) kullanılarak yapılmıştır. Benzer testler, tedavi edilen hayvanlarda aktive parsiyel tromboplastin zamanının (APTT) ortalama örnek gün değerlerini her grup için ilaç uygulamasından önceki değerlerle karşılaştırmak için de yapılmıştır (MSExcel;v16.61.1).

Sonuçlar
Trametinib doz sunumu

Prensip doz ve tahlil doğrulama çalışmasının ön kanıtında, dört naif köpekte elde edilen tek oral doz plazma trametinib konsantrasyonlarının biyoanaliz sonuçları tutarsızdı ve sıklıkla tahlil saptama sınırı olan 0,1 ng/ml’nin altındaydı (Charles River Labs, Mattawan, MI) (Şekil 1). Bu analitik bulgular, hayvanların açlık koşullarında bile, NCI Klinik Farmakoloji Programı’nda bağımsız olarak doğrulanmıştır. Bu sonuç, başlangıçta dağıtılan trametinib formülasyonunun laboratuvar köpeklerinde zayıf emilimden muzdarip olduğu şeklinde yorumlanmıştır. Sonuç olarak, trametinib bu çalışma için insan formülasyonu (MEKINIST , Novartis) ile tutarlı olacak şekilde, eşitolar dimetil sülfoksit (DMSO) (Wedgewood Pharmacy, Swedesboro, NJ) ile sülfatlanarak yeniden formüle edilmiş ve sonraki tüm değerlendirmeler için kullanılmıştır.

Sapanisertib’in doz yükseltme tolerabilitesi

Sapanisertib ile ilgili ilk çalışmalar, tümör taşımayan laboratuvar beagle köpeklerinde oral yoldan uygulanan trametinib dimetil sülfoksit (trametinib) ile kombinasyon halinde nihai test için doz seçimine odaklanmıştır. Trametinib dozu, insan ilaç onayı (MEKINIST , Novartis) için hazırlanan köpek klinik dışı yasal bilgilerinden seçilirken, ideal sapanisertib başlangıç dozu ve programı farelerde yapılan önceki çalışmalara (ayrıca bkz. materyaller ve yöntemler) ve iki köpekte tek başına sapanisertib kullanılarak yapılan bir pilot eskalasyon denemesine dayanmaktadır.

≥ 0,5 mg/kg sapanisertib uygulamasını takiben, her iki cinsiyette de kırmızı kan hücresi retikülosit sayılarında orta ila belirgin düşüşler, serum alkalin fosfataz (ALP) [çalışma öncesi değerin 0,36 katı kadar düşük], aspartat aminotransferaz (AST) (0,68 kat kadar düşük) ve alanin aminotransferaz (ALT) (0,41 kat kadar düşük) değerlerinde minimal ila orta düzeyde düşüşler görülmüştür (Şekil 2B). ≥ 0,65 mg/kg uygulamasını takiben, serum kolesterol konsantrasyonlarında her iki cinsiyette de minimal ila hafif artışlar, periferik kan lenfosit sayılarında hafif ila orta dereceli progresif düşüşler (0,33x kadar düşük), kadınlarda nötrofil sayılarında hafif ila orta dereceli düşüşler (0,24x kadar düşük) ve erkeklerde globulin konsantrasyonlarında hafif artışlar (1,33x’e kadar, globulin, gösterilmemiştir) görülmüştür. Erkekte 0,8 mg/kg sapanisertib uygulamasını takiben, bir kusma epizoduyla ilişkili olabilecek sodyum (0,98x) ve klorür (0,89x) serum konsantrasyonlarında da hafif azalma görülmüştür (Şekil 2B). Takip eden kombinasyon tekrar dozu çalışmasını başlatmak için 0,1 mg/kg sapanisertib seçimi bu bulgular ışığında yapılmıştır.

4 köpekten oluşan gruplara (2 K, 2 E) ya tek ajan ya da iki ilaçlı kombinasyon uygulanmıştır. Her iki ilacın plazma konsantrasyonu, ilk tek oral dozun (1. Gün) ardından ve 4-20. günlerde tekrarlanan dozlama sırasında zaman içinde ölçülmüştür (Tablo 1). Trametinib günde 0,025 mg/kg (q.d.) dozunda ve sapanisertib gün aşırı 0,1 mg/kg (QOD) dozunda verilmiştir. CMAX, TMAX, AUC ve T1/2 sırasıyla trametinib ve sapanisertib için Tablo 4, 5’te belirtilmiştir. CMAX veya AUC, her iki ilaç için de erkek ve dişi köpekler arasında belirgin bir farklılık göstermemiştir (p > 0.05).

İlk dozlamayı takiben TMAX, tek başına veya kombinasyon halinde verilen her bir ilaç karşılaştırıldığında benzerdi (Tablo 4, 5). Trametinibin plazma seviyeleri, hem tek ajan olarak verildiğinde Grup 1 (Şekil 3A) hem de iki ilaç kombinasyonu olan Grup 3 (Şekil 3B) için 1. günden 20. güne kadar biyoakümülasyona dair kanıtlar (3-4 kat artış) ortaya koymuştur. Trametinibin uzun yarılanma ömrü de belirgindi, ancak birçok deneğin tahminleri yetersiz korelasyonlar nedeniyle kullanılamadı (r2 < 0,8) (Tablo 4).

Tek başına trametinib ile karşılaştırıldığında sapanisertib ile kombinasyondan elde edilen trametinib ilaç konsantrasyonları üzerindeki potansiyel etkiye ilişkin kritik bir soru, iki tedavi (Grup 1 ve 3) arasında geometrik ortalama orana (GMR) göre hem ilk doz (1. gün) hem de kararlı durum (20. gün) maruziyet ölçümleri (hem CMAX hem de AUC) %90 güven aralığı (CI) ile karşılaştırılarak yanıtlanmıştır. %90 Güven Aralığı trametinib için varsayılan 0,8 – 1,25 etkisizlik eşiğini aşmasına rağmen, GMR genellikle 1,0’a yaklaşmıştır (Tablo 4), bu da sapanisertibin trametinib PK üzerinde sınırlı etkisi olduğunu veya hiç etkisi olmadığını göstermektedir.

İlk ve tekrar doz sapanisertib hızla emilmiştir (aralık 1-4 saat) (Tablo 5). Trametinibin aksine, sapanisertibin
çok daha kısa yarılanma ömrü (aralık 4,8-6,8 saat) nedeniyle 1. günden 20. güne kadar tekrarlanan dozlarda önemli ölçüde birikim göstermediği gözlenmiştir (Şekil 4; Tablo 5). Bu durum, bir önceki dozdan yaklaşık 24 saat sonra (Grup 2,3) tespit edilebilir minimum sapanisertibin gözlendiği 15. gündeki plazma seviyeleri ile de desteklenmektedir (Şekil 4).

Klinik gözlemler ve hematoloji parametreleri ile değerlendirilen tekrar dozu tolerabilitesi

Tekrar eden dozlarla 17 güne kadar tedavi edilen köpeklerde ciddi yan etkiler veya doz sınırlayıcı toksisiteler görülmemiştir.

Tedaviyle ilişkili klinik belirtiler arasında geçici yumuşak veya mukoid dışkılama epizodları (n = 8), kusma (n = 2) veya ciltte renk değişikliği (n = 2) yer almıştır (Şekil 5). Gözlenen yan etkiler (grade 1,2) müdahale gerektirmemiştir ve tek ajan ve kombinasyon tedavi gruplarında sapanisertib’e ilişkilendirilmiştir. Birer köpekte daha dişlerde renk değişikliği (22001) veya kızgınlık belirtileri (24501) görülmüştür. Üç tedavi koşulundan herhangi birine bağlı olarak tekrar eden doz çalışması süresince her iki cinsiyet için de vücut ağırlığı üzerinde önemli bir etki kaydedilmemiştir (Şekil 6).

Çeşitli dönemlerde tedavi etkilerinin izlenmesini kolaylaştırmak için hematoloji, serum kimyası, koagülasyon ve idrar tahlili için numune alınmış ve elde edilen değerler her denek için tedavi öncesi yapılan ölçümlerle karşılaştırılmıştır (Tablo 1). Genel olarak mütevazı olmakla birlikte, tedavi bazı klinikopatolojik parametreleri değiştirmiştir. Üç köpekte dolaşımdaki kan nötrofillerinde hafif artış görülmüştür (Şekil 7). Nötrofiller, 20. ve 25. günlerde sadece sapanisertib (Grup 2) alan bir erkek (23002) ve bir dişide (23501) çalışma öncesi bireysel değerlerin 1,95 katına kadar artmıştır. İki ilaç kombinasyonunu alan bir 3. Grup erkekte (24001) 6 ila 25. günlerde kan nötrofillerinde 2,6 kata kadar artış görülmüştür.

6-25. günlerde, tüm tedavi gruplarındaki her iki cinsiyette de bireysel mutlak retikülosit sayılarında (0,12x kadar düşük) minimal ila belirgin şekilde düşüşler görülmüştür (Şekil 8). Tipik olarak, bu durum kırmızı hücre dağılım genişliğinde (RDW) tedavi öncesi değerin 0,82 katına kadar (kırmızı kan hücresi boyutundaki değişkenliğin azaldığını göstermektedir) eşzamanlı düşüşlerle birlikte meydana gelmiştir. Ek olarak, 12 köpekten 10’u 6. günden 25. güne kadar bireysel kırmızı kan hücresi kütle parametrelerinde (eritrosit sayısı, hemoglobin konsantrasyonu ve/veya hematokrit; 0,81x kadar düşük) minimal ila hafif düşüşler sergilemiştir (Ek Şekil S2). Son dozlamadaki 20. gün ile karşılaştırıldığında, 25. gün örneklemesi, daha yüksek retikülosit korpusküler hemoglobin içeriği (CHr) ve ortalama retikülosit korpusküler hacmi (MCVr) ile birlikte dolaşımdaki retikülositlerin iyileşmesine yönelik bir eğilim ortaya koymuştur (Şekil 8) (veriler gösterilmemiştir). Bu durum, ilaç kesildikten sonra tüm tedavi gruplarında daha büyük taze kırmızı kan hücrelerinin ortaya çıkmasıyla tutarlılık göstermiştir.

Tedaviden önce ve izlemin sonunda toplanan idrar örnekleri analiz edilmiştir. 25. Günde, sadece trametinib verilen bir erkek köpek (22001), sadece sapanisertib verilen dört köpekten üçü ve trametinib artı sapanisertib kombinasyonuyla tedavi edilen dört köpekten ikisinin idrar protein konsantrasyonunda (idrar çubuğu ile kantitatif olarak ölçülenden daha büyük) yarı belirgin artışlar ölçülen ≥1.000 mg/dL’ye kadar minimum ila çalışma öncesi kaydedilen değerler vardı (Ek Tablo S1).

Ayrıca, Grup 2 (sadece sapanisertib) ve 3’teki (kombinasyon) her iki cinsiyetten hayvanlarda idrar glukozunda minimal ila hafif artışlar olmuştur (idrar çubuğu ile yarı kantitatif olarak ölçülen 250 mg/dL’ye kadar). Grup 2’deki erkeklerde ve Grup 3’teki her iki cinsiyette de idrar pH’ında orta derecede artışlar görülmüştür (pH ≥ 9,0’a kadar). İdrar proteini, glukoz ve pH’daki bu artışların trametinib, sapanisertib ve/veya trametinib artı sapanisertib uygulaması ile ilişkili olduğu düşünülmüştür.

Tedavilerin kan pıhtılaşmasının laboratuvar analizini etkileme potansiyeli de incelenmiştir. Çeşitli dönemlerde bireysel hayvan fibrinojen konsantrasyonunda (2,61 kata kadar) minimal ila orta düzeyde artışlar görülmüş olup, bu artışlar en çok kombinasyon uygulanan Grup 3 örneklerinde belirgin olmuştur (Ek Şekil S3A). Kan fibrinojen konsantrasyonundaki bu artışların trametinib, sapanisertib ve trametinib artı sapanisertib kombinasyonu uygulaması ile ilişkili olduğu düşünülmüştür. Tedavi öncesi örneklerle karşılaştırıldığında, aktive parsiyel tromboplastin zamanı (APTT) testi, sadece sapanisertib verilen bir erkek ve bir dişi köpekte ve iki ilaç kombinasyonu ile tedavi edilen her iki erkek ve bir dişi köpekte 6, 11, 15, 22 ve/veya 25. günlerde tedavi sırasında 1,21 kata kadar uzamıştır (Ek Şekil S3B). Tek başına veya kombinasyon halinde sapanisertib alan köpekler için grup ortalama APTT değerlerinin daha detaylı analizi, tek başına trametinib alan köpeklere kıyasla 11. gün ve sonrasında sürekli olarak anlamlı farklılıklar ortaya koymuştur. Buna ek olarak, tek başına veya kombinasyon halinde sapanisertib alan köpekler için bu ortalama APTT değerleri de tüm köpeklerin tedavi öncesi ortalama değerlerinden belirgin şekilde farklıydı. Bu olası sapanisertib tedavisi etkisine rağmen, tedavi edilen köpeklerin analiz edilen APTT değerlerinin hiçbiri normal köpek referans aralığı üst sınırlarını aşmamıştır ve bu çalışmada klinik olarak anlamlı bulunmamıştır (Ek Şekil S3B). Protrombin zamanı (PT) testleri için benzer bir etki görülmemiştir.

Tedavi sırasında çeşitli serum biyokimyasal parametreleri arasında birkaç küçük dalgalanma daha meydana gelmiştir. Bu minimal biyokimyasal değişiklikler müdahale gerektirmemiştir. Bununla birlikte, bazı gözlemler özetlenmiştir (Ek Dosya 1) ve spontan kanserleri ve potansiyel komorbiditeleri olan yaşlı köpeklerde daha etkili olabilecek terapötik sonuçların olası işaretleri olarak değerlendirilebilir.

Tartışma

MEK ve mTOR’un kombine hedeflenmesi birçok preklinik kanser modeli sisteminde başarıyla uygulanmış ve karaciğer ve pankreas kanserlerinde edinilmiş ilaç direncinin bazı formlarının üstesinden gelmek için fırsatl yaratmıştır 1. (23, 24). Bu hassas hedefleme yöntemi, özellikle glioblastoma (25) ve melanomada (13) kombine trametinib ve sapanisertibin sinerjik paralel kullanımı ile uygulanmıştır.

Bu köpek çalışmasında trametinib ile kombinasyon halinde sapanisertib kullanımı, gün aşırı uygulama programı kullanan bir fare modeline (13) ve bu çalışmada açıklanan doz artırımımıza göre yapılmıştır. Sapanisertib, insanlar için çeşitli dozlar ve programlar aracılığıyla klinik araştırma geliştirme altında devam etmektedir (17). Kilo kaybı, hemogram ve idrar tahlillerinde ≥0,1 mg/kg dozlarda meydana gelen dalgalanmalar göz önünde bulundurulduğunda, tekrar tekrar uygulanan oral dozun köpeklerde en iyi tolere edilen seviye olduğu görülmüştür. Daha önce köpekler için mevcut olan Trametinib klinik dışı doz ve program verileri (21) günlük 0.025 mg/kg trametinib oral uygulamasına rehberlik etmiştir.

Tüm gruplardaki tedaviler kırmızı kan hücrelerini azaltma ve akut faz enflamatuar reaksiyonu tetikleme eğiliminde olup, bu reaksiyon kan örneklerinde öncelikle dolaşımdaki nötrofillerin artması, fibrinojenin artması, serum albümininin azalması ve globülinin artması ile karakterize edilmiştir. Hemogram ve biyokimyasal parametreler sapanisertib ve/veya trametinibe yanıt olarak tedavi öncesi ölçümlerden farklılık gösterse de, değişiklik dereceleri sınırlıydı ve nadiren normal sağlıklı beagle köpek referans aralığı değerlerinin önemli ölçüde dışına çıkıyordu.

Proteinüri, glikozüri ve idrar pH’sında artış en çok sapanisertib ve kombinasyonla tedavi edilen köpeklerde belirgindi ve esas olarak sapanisertib ile tedaviye atfedilebilecek renal etkiler şeklinde yorumlandı. Klinik öncesi bir modelde, günde 2,5 mg/Kg sapanisertib verilen bazı farelerde orta derecede histopatolojik kortikal tübüler epitelyal dejenerasyon ve nekroz ile birlikte akut böbrek hasarı (AKI) gözlenmiştir (13). Buna karşın, aynı dozda sapanisertib ile gün aşırı tedavi edilen farelerde belirgin AKI görülmemiş, bunun yerine doku kesitlerinde tek tek tübüler hücre mitozunun eşlik ettiği izole ve ayrık renal tübüler hücre ölümü görülmüştür, bu da telafi edici rejenerasyon ile düşük gradeli hücre döngüsünün göstergesidir. Köpeklerde kullanılan 0,1 mg/kg sapanisertib dozu, farelerde kullanılan 2,5 mg/kg’dan (13) daha düşük kabul edilmiştir; bu doz köpeklerde yaklaşık olarak 0,37 mg/kg’a eşdeğerdir (20). Bununla birlikte, farelerde sapanisertib maruziyetine benzer renal ilaç etkilerinin ortaya çıkma potansiyeli, tedavi edilen köpeklerde, özellikle nefropatisi olan hastalarda göz önünde bulundurulmalıdır.

Bazı köpeklerde, özellikle tedavi grubu 2 ve 3’te belgelenen APTT’deki uzamalar, olası sapanisertib ile sapanisertib ve trametinib kombinasyon ilaç etkilerine işaret ediyor gibi görünmektedir. İhtiyatlı olunması gerekmekle birlikte, tüm uzun süreli APTT değişiklikleri minimal düzeydeydi ve tedavi edilen hayvanlar için elde edilen değerler normal köpek referans aralığı (veya altında) içindeydi; bu çalışmada herhangi bir klinik müdahale veya ilaç dozu ayarlaması gerekmemiştir. Bununla birlikte, ilaca maruz kalma süresi nispeten kısa sürmüştür ve tedavinin in vitro test üzerindeki minör etkinin ötesinde köpek kanser hastalarında koagülasyon kaskadlarını etkileme potansiyeli göz önünde bulundurulmalıdır.

CMAX ve AUC dahil olmak üzere mevcut çalışmada elde edilen trametinib PK parametreleri, daha önce yasal kurumlara bildirilen köpek değerlerini büyük ölçüde tekrarlamıştır (28). Benzer şekilde, mevcut çalışmadaki erkek ve dişi köpekler karşılaştırıldığında CMAX ve AUC değerlerinde önemli farklılıkların olmaması da bu yasal sonuçları yansıtmaktadır.

Trametinibin köpeklerde (0.37 L/saat/kg) insanlara (0.07 L/saat/kg; MEKINIST Reçete Bilgisi) kıyasla daha hızlı klerensi, trametinibin köpeklerde (32 L/kg) insanlara (3.1 L/kg) kıyasla daha geniş dağılım hacmiyle ilişkili olarak, protein bağlanmasındaki farklılıklardan kaynaklanıyor olabilir, çünkü trametinib insan serum albüminine %97 oranında bağlanmaktadır. Genel olarak, 0,025 mg/kg günlük rejimi (ortalama 8 kg’lık bir beagle köpeği için yaklaşık 0,2 mg doz) takiben 20. günde (69 saat∗ng/mL) trametinibin sistemik maruziyeti (AUCTAU), 2 mg doz verilen insanların maruz kaldığının yaklaşık 1/3’ü kadardır (31). Ancak, türler arası PK karşılaştırmaları yapılırken, bu çalışmada sadece dört köpek deneğin tek başına trametinib alması nedeniyle dikkatli olunmalıdır.

Maalesef, spesifik CYP izoformunu doğrulamak için yayınlanmış kanıtlar ortaya çıkarılmamıştır, ancak bu köpek çalışmasına dayanarak, CYP3A ailesi indüksiyonu potansiyel bir metabolik mekanizma olarak görünmektedir.

Köpeklerin 0,1 mg/kg (ortalama 7,4 kg olan beagle cinsi köpekler için kabaca 0,55-0,85 mg) sapanisertib maruziyetlerinin, faz II denemelerine dahil edilen bir doz seviyesi olan 4 mg oral sapanisertib alan insan kanser hastalarının PK’sı ile türler arası karşılaştırması, benzerlikler ortaya koymuştur (35). Ortalama hayvan-insan maruziyet oranları (sadece köpek sapanisertib grubu) CMAX için 1.11, AUCINF için 1.31 ve T1/2 için 0.91’dir. Bu nedenle, bu köpeklerde elde edilen sapanisertib seviyeleri, insanlarla yapılan bu karşılaştırmaya dayanarak potansiyel klinik önem taşıyacaktır.

Bu inhibitör kombinasyonunun beagle cinsi laboratuvar köpeklerinde değerlendirilmesi, farelerde elde edilen önceki bulguları genişletmekte (13) ve ilaç geliştirme sürecinde gerekli ve faydalı bir adım olarak hizmet etmektedir. Benzer şekilde, genel sonuçların türler arasında doğrulanması, klinik öncesi çalışmalarda sıklıkla bir endişe kaynağı olan bilimsel tekrarlanabilirliği ele alarak elde edilen kanıtların geçerliliğini desteklemektedir (36).

Veri Erişim Beyanı

Bu makalenin sonuçlarını destekleyen ham veriler, yazarlar tarafından, bilimsel araştırma için nitelikli araştırmacılara herhangi bir çekince olmaksızın sunulacaktır.

Etik Beyan

Bu çalışma AAALAC tarafından akredite edilmiş hayvan tesislerinde [Charles River Laboratories, Mattawan, MI; NIH Laboratuvar Hayvanları Sağlık Hizmetleri Ofisi onayı (https://olaw. nih.gov/assured/app/index.html)], tesisin Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Komitesi’nin inceleme, izleme ve onayı altında, ABD Halk Sağlığı Servisi’nin laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin ulusal kılavuz ve yönetmeliklerine uygun olarak yürütülmüştür.

Katkıda bulunan yazarlar

B-RW ve RS çalışmayı tasarlamış, yönetmiş, sonuçları analiz etmiş ve yorumlamış, makaleyi yazmış ve onaylamıştır. CP, WR ve WF farmakokinetik numuneleri ve verileri analiz etmiş, sonuçları yorumlamış ve makaleyi düzenleyip onaylamıştır. SH çalışma tasarımına, veri analizine katkıda bulunmuş, sonuçları yorumlamış ve makaleyi düzenleyip onaylamıştır. Tüm yazarlar makaleye katkıda bulunmuş ve gönderilen versiyonu onaylamıştır.

Finansman

Bu araştırma Intramural Araştırma Programı, Kanser Araştırma Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda, Maryland tarafından desteklenmiştir. Bu destek, NCI Federal Olarak Finanse Edilen Araştırma ve Geliştirme Merkezi belirsiz süreli Sözleşme Numaraları aracılığıyla elde edilen araştırma hizmetlerini içermektedir: 75N91019D00024; 75N91020F00003 ile Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Ulusal Kanser Araştırmaları Laboratuvarı, Frederick, Maryland.

Çıkar Çatışması Beyanı

Ulusal Kanser Enstitüsü ve Frederick Ulusal Kanser Araştırma Laboratuvarı, burada incelenen kinaz inhibitörlerinden herhangi biri üzerinde mülkiyet hakkına veya başka bir mülkiyet çıkarına sahip değildir. Her iki kurum da her iki ilacın onaylanması veya izlenmesi konusunda herhangi bir yasal yetkiye sahip değildir. Yazar B-RW, Ulusal Kanser Enstitüsü’nden bir devlet araştırma hizmetleri sözleşmesi kapsamında Leidos Biomedical Research, Inc. tarafından istihdam edilmiştir. Şirketin bu araştırmanın başlatılmasında, tasarımında, gözetiminde veya bu araştırmadan kaynaklanan araştırma iletişiminde hiçbir rolü yoktur.

Diğer yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmaksızın yürütüldüğünü beyan etmektedirler.

Yayıncının Notu

Bu makalede ifade edilen tüm iddialar yalnızca yazarlara aittir ve bağlı oldukları kuruluşların veya yayıncının, editörlerin ve hakemlerin iddialarını temsil etmeyebilir. Bu makalede değerlendirilebilecek herhangi bir ürün veya üreticisi tarafından ileri sürülebilecek herhangi bir iddia, yayıncı tarafından taahhüt edilmemekte veya desteklenmemektedir.

Ek Materyaller

Bu çalışmaya ilişkin Ek Materyallere şu adresten erişilebilir https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2022.1056408/full#supplementary-material

Kaynakça

1. 1. 1. London CA, Small molecule inhibitors in veterinary oncology practice. Vet Clin North Am Small Anim Pract. (2014) 44:893– 908. doi: 10.1016/j.cvsm.2014.06.001

      2. Musser ML, Taikowski KL, Johannes CM, Bergman PJ. Retrospective evaluation of toceranib phosphate (Palladia) use in the treatment of inoperable, metastatic, or recurrent canine pheochromocytomas: 5 dogs (2014–2017). BMC Vet Res. (2018) 14:272. doi: 10.1186/s12917-018-1597-7

      3. Thamm DH, Gustafson DL. Drug dose and drug choice: optimizing medical therapy for veterinary Vet Comp Oncol. (2020) 18:143–doi: 10.1111/vco.12537

      4. Zhong L, Li Y, Xiong L, Wang W, Wu M, Yuan T, et al. Small molecules in targeted cancer therapy: advances, challenges, and future perspectives. Signal Transduct Target (2021) 6:201. doi: 10.1038/s41392-021-00572-w

      5. Lee PY, Yeoh Y, Low A recent update on small-molecule kinase inhibitors for targeted cancer therapy and their therapeutic insights from mass spectrometry- based proteomic analysis. FEBS J. (2022). doi: 10.1111/febs.16442

      6. Welsh SJ, Rizos H, Scolyer RA, Long Resistance to combination BRAF and MEK inhibition in metastatic melanoma: where to next? Eur J Cancer. (2016) 62:76–85. doi: 10.1016/j.ejca.2016.04.005

      7. Yuan J, Dong X, Yap J, Hu The MAPK and AMPK signalings: interplay and implication in targeted cancer therapy. J Hematol Oncol. (2020) 13:113. doi: 10.1186/s13045-020-00949-4

      8. Hoxhaj G, Manning BD. The PI3K–AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer Nat Rev Cancer. (2020) 20:74–doi: 10.1038/s41568-019-0216-7

      9. Das S, Idate R, Cronise KE, Gustafson DL, Duval DL. Identifying candidate druggable targets in canine cancer cell lines using whole-exome sequencing. Mol Cancer (2019) 18:1460–71. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-18-1346

      10. Elbadawy M, Sato Y, Mori T, Goto Y, Hayashi K, Yamanaka M, et Anti-tumor effect of trametinib in bladder cancer organoid and the underlying mechanism. Cancer Biol Ther. (2021) 22:357–doi: 10.1080/15384047.2021.1919004

      11. Simpson RM, Bastian BC, Michael HT, Webster JD, Prasad ML, Conway CM, et Sporadic naturally occurring melanoma in dogs as a preclinical model for human melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. (2014) 27:37–doi: 10.1111/pcmr.12185

      12. Ma Y, Xia R, Ma X, Judson-Torres RL, Zeng H. Mucosal melanoma: pathological evolution, pathway dependency and targeted therapy. Front Oncol. (2021) 11:702287. doi: 3389/fonc.2021.702287

      13. Wei BR, Hoover SB, Peer CJ, Dwyer JE, Adissu HA, Shankarappa P, et al. Efficacy, tolerability, and pharmacokinetics of combined targeted MEK and Dual mTORC1/2 inhibition in a preclinical model of mucosal melanoma. Mol Cancer (2020) 19:2308–18. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-19-0858

      14. Mendoza MC, Er EE, Blenis The Ras-ERK and PI3K-mTOR pathways: cross-talk and compensation. Trends Biochem Sci. (2011) 36:320–doi: 10.1016/j.tibs.2011.03.006

      15. Fowles JS, Denton CL, Gustafson Comparative analysis of MAPK and PI3K/AKT pathway activation and inhibition in human and canine melanoma. Vet Comp Oncol. (2015) 13:288–304. doi: 10.1111/vco.12044

      16. Segaoula Z, Primot A, Lepretre F, Hedan B, Bouchaert E, Minier K, et Isolation and characterization of two canine melanoma cell lines: new models for comparative oncology. BMC Cancer. (2018) 18:1219. doi: 10.1186/s12885-018-5114-y

      17. Voss MH, Gordon MS, Mita M, Rini B, Makker V, Macarulla T, et Phase 1 study of mTORC1/2 inhibitor sapanisertib (TAK-228) in advanced solid tumours, with an expansion phase in renal, endometrial or bladder cancer. Br J Cancer. (2020). doi: 10.1038/s41416-020-01041-x

      18. Grimaldi AM, Simeone E, Festino L, Vanella V, Strudel M, Ascierto PA, et Inhibitors in the treatment of metastatic melanoma and solid tumors. Am J Clin Dermatol. (2017) 18:745–54. doi: 10.1007/s40257-017-0292-y

      19. Wei BR,Michael HT, Halsey CH, Peer CJ, Adhikari A, Dwyer JE, et al. Synergistic targeted inhibition of MEK and dual PI3K/mTOR diminishes viability and inhibits tumor growth of canine melanoma underscoring its utility as a preclinical model for human mucosal melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. (2016) 29:643–55. doi: 1111/pcmr.12512

      20. Nair AB, Jacob A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. (2016) 7:27–doi: 4103/0976-0105.177703

      21. CHMP Assessment Report, Mekinist, International Non-proprietary Name: Trametinib, Procedure No.: EMEA/H/C/002643/0000. (2014). Available online at: https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/mekinist-epar- public-assessment-report_en.pdf (accessed November 22, 2022).

      22. Takada M, Hix JML, Corner S, Schall PZ, Kiupel M, Yuzbasiyan-Gurkan Targeting MEK in a translational model of histiocytic sarcoma. Mol Cancer Ther. (2018) 17:2439–50. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-17-1273

      23. Liu X, Hu J, Song X, Utpatel K, Zhang Y, Wang P, et Combined treatment with MEK and mTOR inhibitors is effective in in vitro and in vivo models of hepatocellular carcinoma. Cancers. (2019) 11:930. doi: 10.3390/cancers11070930

      24. Brown WS, McDonald PC, Nemirovsky O, Awrey S, Chafe SC, Schaeffer DF, et al. Overcoming adaptive resistance to KRAS and MEK inhibitors by co- targeting mTORC1/2 complexes in pancreatic Cell Reports Medicine. (2020) 1:100131. doi: 10.1016/j.xcrm.2020.100131

      25. Schreck KC, Allen AN, Wang J, Pratilas Combination MEK and mTOR inhibitor therapy is active in models of glioblastoma. Neurooncol Adv. (2020) 2:vdaa138. doi: 10.1093/noajnl/vdaa138

      26. Jafari M, Ghadami E, Dadkhah T, Akhavan-Niaki PI3k/AKT signaling pathway: erythropoiesis and beyond. J Cell Physiol. (2019) 234:2373–doi: 10.1002/jcp.27262

      27. Tóthová Z, Šemeláková M, Solárová Z, Tomc J, Debeljak N, Solár The role of PI3K/AKT and MAPK signaling pathways in erythropoietin signalization. Int J Mol Sci. (2021) 22:7682. doi: 10.3390/ijms22147682

      28. Australian Public Assessment Report for trametinib (as dimethyl sulfoxide), Proprietary Product Name: Mekinist 2014. Available online at: https://www.tga. au/sites/default/files/auspar-trametinib-140317.pdf (accessed November 22, 2022)

      29. Infante JR, Fecher LA, Falchook GS, Nallapareddy S, Gordon MS, Becerra C, et Safety, pharmacokinetic, pharmacodynamic, and efficacy data for the oral MEK inhibitor trametinib: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet Oncol. (2012) 13:773–81. doi: 10.1016/S1470-2045(12)70270-X

      30. Pharmacology/Toxicology NDA Review and Evaluation, Application Number: 204114Orig1s000. (2012). Available online at: https://www.accessdata.fda.gov/ drugsatfda_docs/nda/2013/204114Orig1s000PharmR.pdf (accessed November 22, 2022).

      31. Leonowens C, Pendry C, Bauman J, Young GC, Ho M, Henriquez F, et al. Concomitant oral and intravenous pharmacokinetics of trametinib, a MEK inhibitor, in subjects with solid Br J Clin Pharmacol. (2014) 78:524–doi: 1111/bcp.12373

      32. Patel C, Goel S, Patel MR, Rangachari L, Wilbur JD, Shou Y, et Phase 1 study to evaluate the effect of the investigational anticancer agent sapanisertib on the QTc interval in patients with advanced solid tumors. Clin Pharmacol Drug Dev. (2020) 9:876–88. doi: 10.1002/cpdd.808

      33. Lugowska I, Koseła-Paterczyk H, Kozak K, Rutkowski P. Trametinib: a MEK inhibitor for management of metastatic melanoma. Onco Targets Ther. (2015) 8:2251–9. doi: 2147/OTT.S72951

      34. MEKINIST Prescribing Information. (2014). Available online at: https://www. com/us-en/sites/novartis_us/files/mekinist.pdf (accessed November 22, 2022).

      35. Ghobrial IM, Siegel DS, Vij R, Berdeja JG, Richardson PG, Neuwirth R, et TAK-228 (formerly MLN0128), an investigational oral dual TORC1/2 inhibitor: a phase I dose escalation study in patients with relapsed or refractory multiple myeloma, non-Hodgkin lymphoma, or Waldenstrom’s macroglobulinemia. Am J Hematol. (2016) 91:400–5. doi: 10.1002/ajh.24300

      36. Freedman LP,  Cockburn  IM,  Simcoe    The  Economics of reproducibility in preclinical research. PLoS Biol. (2015) 13:e1002165. doi: 10.1371/journal.pbio.1002165

      37. Bertout JA, Baneux PJR, Robertson-Plouch Recommendations for ethical review of veterinary clinical trials. Front Vet Sci. (2021) 8:715926. doi: 10.3389/fvets.2021.715926

      38. Bracken Why animal studies are often poor predictors of human reactions to exposure. J R Soc Med. (2009) 102:120–doi: 1258/jrsm.2008.08k033

      39. The Beginnings: Laboratory and Animal Studies. (2015). Available online at:          https://www.fda.gov/drugs/information-consumers-and-patients-drugs/ beginnings-laboratory-and-animal-studies (accessed November 22, 2022).